一种新型透明质酸(hyaluronic acid, HA)/壳聚糖(chitosan, CS)/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)三元复合水凝胶支架用于牙周再生：一项实验研究

《BMC Oral Health》：A novel composite hyaluronic acid/chitosan/polyvinyl alcohol ternary hydrogel scaffold for periodontal regeneration: an experimental study

　　

背景：分叉缺陷因牙周装置复杂性、难以接近及局部血供有限，被视为最具挑战性的牙周病变之一。本研究旨在制备并表征一种由透明质酸(HA)、壳聚糖(CS)和聚乙烯醇(PVA)组成的新型三元水凝胶，并评估其在犬分叉缺陷牙周再生中的潜力。材料与方法：研究人员成功制备了透明质酸、壳聚糖和聚乙烯醇复合水凝胶支架，并从扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)、溶胀与力学行为、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析、生物相容性测定及细胞-支架直接相互作用方面进行表征。在体内研究中，在八只杂种犬中建立三十二个临界尺寸Ⅱ类分叉缺陷，随机分为Ⅰ组（水凝胶组）和Ⅱ组（阴性对照组）。术后1个月和3个月通过组织学分析及新生骨面积百分比的形态计量学评估新型水凝胶的再生潜力。结果：制备的水凝胶具有细胞相容性、适当的降解率、吸水率、力学强度及临床操作便利性。水凝胶组在两个时间点的组织学结果均显示骨、牙周韧带和牙骨质形成优于阴性对照组。水凝胶组新生骨表面积百分比较阴性对照组显著增加。结论：采用透明质酸、壳聚糖和聚乙烯醇制备的新型三元水凝胶具有足够的细胞相容性和力学性能。体内结果支持该新型支架可能有效促进犬分叉缺陷的牙周再生。

研究背景方面，分叉缺陷因牙周装置复杂、部位深在及血供受限，是牙周再生领域极具挑战的病变类型。传统非手术牙周治疗可改善临床状况但无法完全再生丧失组织，引导组织再生(guided tissue regeneration, GTR)技术虽引入屏障膜理念，但在复杂缺损地形中可预测性仍存疑。组织工程学提出支架、干细胞与生长因子复合策略，理想支架需具备生物相容性、多孔结构、匹配力学强度与降解速率。天然聚合物如透明质酸(HA)、壳聚糖(chitosan, CS)生物活性佳但力学与稳定性不足，合成聚合物如聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)力学优异但生物相容性与生物活性偏低。为结合二者优势，研究人员拟开发HA/CS/PVA三元复合水凝胶支架，并在犬Ⅱ类分叉临界尺寸缺陷模型中验证其牙周再生潜力。该研究发表于《BMC Oral Health》。

关键技术方法包括：通过不同浓度与HA/CS重量比（6/1、6/3、6/6、3/3）优化制备四种水凝胶，采用SEM观察超微结构与孔径分布，测定生理盐液中溶胀行为与30天湿重损失，通过质地分析仪检测压缩强度与杨氏模量，FTIR分析官能团与聚电解质复合形成。生物相容性通过骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)条件培养基MTT法评估细胞活力，共聚焦显微镜观察细胞在支架表面黏附与浸润。体内实验选用8只12–20月龄健康杂种犬，下颌前磨牙双侧制造32个5 mm高×3 mm深Ⅱ类分叉临界尺寸缺陷，随机分水凝胶组与阴性空白对照组，术后1个月与3个月处死取材，中性缓冲福尔马林固定后脱钙、石蜡包埋、苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色行组织学评价，ImageJ软件进行新生骨表面积百分比形态计量分析，统计学采用配对t检验。

研究结果部分，首先为Formulation of innovative (HA/CS/PVA)，研究人员通过聚电解质复合制备四种不同HA/CS比例与总浓度的水凝胶（Hydrogel?1至4），其中PVA 2% w/v通过冻干物理交联增强力学，经后续表征筛选最优配方。Scanning electron microscopy (SEM)结果显示，Hydrogel?1（HA/CS 6/1）基质塌陷、孔结构不清；Hydrogel?2（6/3）与Hydrogel?3（6/6）随CS增加呈均一互连孔结构，孔径分别为23.56 ± 5.8 μm与57.35 ± 11.62 μm；Hydrogel?4（3/3）孔径显著最大达142.12 ± 33.34 μm，利于骨传导。Water uptake potential表明Hydrogel?1 1小时完全液化侵蚀；Hydrogel?2至4逐渐溶胀，4小时溶胀率分别为845 ± 11%、1749.82 ± 97.77%、1662.8 ± 48.6%，30天湿重损失率Hydrogel?4 > Hydrogel?3 > Hydrogel?2。Compressive strength中Hydrogel?1最低（45 ± 6.12 kPa），Hydro?gel?2最高（139.33 ± 16.02 kPa），Hydrogel?3为87 ± 9.89 kPa，Hydrogel?4为70.66 ± 2.82 kPa；杨氏模量Hydrogel?2最高（1.85 ± 0.19 kPa），孔径与力学呈反比。综合选定Hydrogel?4（HA 3% w/v、CS 3% w/v、PVA 2% w/v）为HA/CS/PVA进行后续研究。Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR)显示CS在1563 cm^?1质子化NH₃⁺与HA在1610 cm^?1羧基相互作用形成聚电解质复合，各组分特征峰均保留。Biocompatibility and Direct Cell–Scaffold Interactions of HA/CS/PVA scaffolds with BMSCs results中，条件培养基2、4、6天浸提液在24与48小时BMSCs活力均>85%，48小时接近或超100%，无延迟细胞毒性；共聚焦见F?actin红染广泛铺展、DAPI蓝染核，证实细胞良好黏附与浸润。

In vivo study results下Histological results显示，1个月水凝胶组致密新生骨达穹窿部，骨髓腔大示成熟中，连续牙周韧带(periodontal ligament, PDL)样组织伴部分纤维插入牙骨质样组织；3个月骨成熟、髓腔缩小、PDL宽度正常纤维定向插入，髓腔偶见残留水凝胶。阴性对照组1个月仅根尖部少量新骨，余为纤维组织伴炎细胞浸润，偶见骨小梁；3个月仍宽髓腔、大部纤维组织充填，部分上皮长入。Histomorphometric results中，1个月水凝胶组新生骨面积36.02 ± 4.42%显著高于对照组3.34 ± 0.70%（P < 0.001），3个月水凝胶组41.80 ± 3.24%显著高于对照组4.28 ± 0.53%。

讨论部分总结，研究人员指出HA、CS、PVA分别提供生物活性、抗菌成骨潜能与力学支撑，三元复合通过聚电解质交联兼顾孔隙、溶胀与强度。犬模型因牙周解剖与人近似被选用于临界尺寸缺陷评价。组织学见水凝胶组早期全层成骨与PDL再生，优于胶原/FGF?2或褪黑素载药水凝胶等既往研究，对照组符合自发愈合有限特征。定量骨面积1个月约36%、3个月约42%，远高于对照组约3–4%，归因于三组分协同成骨及HA抑菌、PVA缓释降解特性。讨论亦提及局限：缺影像学体积密度分析、仅H&E染色、动物模型外推需谨慎、形态计量仅单参数，未来需扩大样本、多染色、多参数及对比既有疗法。

结论部分译为：在本研究局限内，采用HA、CS和PVA制备的新型三元水凝胶表现出细胞相容性、与牙周组织再生相匹配的降解率、适当的吸水与力学性能及临床可接受的操作特性。体内研究组织学与形态计量学结果提示所开发支架可能支持牙周组织再生，相较于未处理缺陷可促进新生骨形成。