EMILIN?1/整合素轴缺失驱动胃肿瘤发生中的微环境重编程

《Gastric Cancer》：Loss of EMILIN-1/integrin axis drives microenvironmental reprogramming in gastric tumorigenesis

　　

背景：EMILIN?1是一种具有抑瘤功能的细胞外基质糖蛋白。尽管其缺失与癌症进展有关，但其在胃肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中的具体作用及其临床相关性仍不明确。方法：研究人员利用体外细胞系统和基因修饰小鼠模型，探讨EMILIN?1功能受损对胃上皮转化、基质重塑和成纤维细胞重编程的影响，采用组织病理学分析、基因表达谱分析和功能实验评估上皮、成纤维和内皮区室的表型变化。结果：研究人员发现胃癌(gastric cancer, GC)细胞通过旁分泌信号在下调基质成纤维细胞和淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells, LECs)中的EMILIN?1，导致EMILIN?1沉积减少和淋巴管结构紊乱。机制上，EMILIN?1与α4β1整合素(intergrin)的相互作用在GC细胞中缺失，调控肿瘤细胞增殖；该轴缺失使肿瘤细胞逃逸细胞外基质(extracellular matrix, ECM)介导的生长控制。此外，EMILIN?1下调将成纤维细胞重编程为促肿瘤表型，增强GC细胞迁移和克隆形成能力。EMILIN?1功能缺失(E955A)小鼠对癌前病变易感性增加，这在人异型增生组织中EMILIN?1显著减少的结果中得到印证。结论：研究结果确立EMILIN?1为胃组织完整性的关键调节因子。其缺失通过破坏上皮稳态、损害淋巴管结构和促进成纤维细胞活化，形成促肿瘤微环境。EMILIN?1在早期人异型增生中持续降低，凸显其作为早期GC风险分层的新型基质生物标志物的潜力。此外，恢复EMILIN?1/整合素轴是重建生长控制和抑制肿瘤进展的有前景的治疗策略。

研究背景方面，胃癌(gastric cancer, GC)仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，多数患者确诊时已属晚期，总体预后较差。既往GC研究主要关注幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染、慢性炎症和基因组不稳定性驱动的上皮转化，而肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)由免疫细胞、血管与淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells, LECs)、成纤维细胞和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)等组成，在塑造肿瘤进展中的关键作用日益受到重视。EMILIN?1是位于弹性蛋白?胶原界面的ECM糖蛋白，在基质成纤维细胞和LECs中高表达，在其他组织中被证明可通过限制细胞增殖、调节淋巴管生成(lymphangiogenesis)和调控转化生长因子?β(transforming growth factor?β, TGF?β)信号发挥抑瘤功能，但其在胃TME中的具体作用和临床意义尚不明确。已有研究提示GC上皮细胞存在ITGA4基因启动子高甲基化导致α₄β₁整合素(intergin)缺失，使其无法与EMILIN?1的gC1q结构域结合，然而GC细胞如何规避EMILIN?1介导的抑制及其缺失如何重塑周围基质的机制尚不清楚。因此，研究人员开展本研究以明确EMILIN?1在胃TME中是否发挥更广泛的调控作用，揭示GC细胞通过双重逃逸策略——抑制基质成纤维细胞和LECs的EMILIN?1产生以及在上皮细胞中丢失其同源受体α₄β₁整合素——来逃避免基质“监视”并促进促肿瘤微环境形成的机制，论文发表于《Gastric Cancer》。

为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：利用体外细胞共培养体系模拟肿瘤?基质相互作用，收集GC细胞条件培养基(conditioned medium, CM)处理基质成纤维细胞和LECs；构建EMILIN?1基因敲除(knockout, KO)和人源E954A突变体过表达的稳定细胞系，以及EMILIN?1功能缺失E955A敲入(knock?in, KI)小鼠模型；通过他莫昔芬(Tamoxifen)和DMP?777诱导小鼠胃壁细胞丢失及痉挛性多肽表达化生(spasmolytic polypeptide?expressing metaplasia, SPEM)以评估癌前病变易感性；收集人胃活检或黏膜切除术标本进行免疫组织化学分析；采用流式细胞术(flow cytometry, FACS)分析整合素表达谱；利用实时无标记细胞功能分析(xCELLigence RTCA)监测细胞黏附与增殖；开展淋巴管形成、伤口愈合和三维球体侵袭等功能实验；并通过蛋白质印迹(Western blot)、逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)和免疫荧光评估分子表型变化。

研究结果部分依次如下：

The EMILIN?1/α₄β₁?integrin axis regulates gastric epithelial proliferation and is bypassed by cancer cells：研究人员通过流式细胞术发现正常胃黏膜GES?1细胞表达α₃、α₄和α_v整合素，而AGS等多种GC细胞系缺失α₄和α₉整合素。黏附实验显示GES?1可通过α₄β₁整合素特异性黏附于EMILIN?1的gC1q结构域，且该黏附可被功能抑制抗体或人gC1q E954A突变体阻断。增殖实验表明gC1q可调控表达α₄β₁整合素的GES?1细胞生长，而对缺失α₄的AGS细胞无影响；在AGS中稳定转染α₄整合素后，细胞恢复对gC1q的黏附能力且增殖受gC1q调控。结果表明α₄β₁整合素是EMILIN?1介导上皮生长控制的必需因子，其缺失使GC细胞逃逸ECM依赖的增殖调控。

Gastric Cancer cell–derived paracrine signals suppress EMILIN?1 in stromal compartments：研究人员将基质成纤维细胞和LECs暴露于不同GC细胞系（NCI?N87、Hs746T、AGS）的CM中，发现GC来源CM可显著下调成纤维细胞和LECs中EMILIN?1的mRNA和ECM蛋白水平，而正常GES?1的CM无此效应，且另一ECM成分纤连蛋白(fibronectin)未被下调反而上调。结肠癌和卵巢癌来源CM也未引起EMILIN?1降低。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在成纤维细胞中未因GC?CM处理而改变，GC?CM中MMP水平亦无增加，提示EMILIN?1减少主要源于转录抑制和/或mRNA稳定性下降而非蛋白降解，且该抑制具有GC特异性。

EMILIN?1 downregulation promotes tumor progression through lymphatic dysfunction and stromal fibroblast activation：研究人员发现GC来源CM损害LECs的管形成能力，表现为总管长、分支点、环和管结构显著减少。EMILIN?1下调使成纤维细胞中α?平滑肌肌动蛋白(alpha?smooth muscle actin, α?SMA)升高，呈现肌成纤维细胞/癌相关成纤维细胞(cancer?associated fibroblasts, CAFs)样表型。CRISPR?Cas9构建的EMILIN?1 KO成纤维细胞本身即具有高基础α?SMA水平及活化的AKT、ERK、NF?κB、STAT3信号和CTGF上调，AGS?CM不能进一步诱导其活化。EMILIN?1 KO成纤维细胞CM可增强AGS和Hs746T细胞迁移、克隆形成能力及三维球体出芽侵袭。结果表明EMILIN?1缺失足以驱动成纤维细胞向促肿瘤CAF样状态重编程并增强GC侵袭性。

Impaired EMILIN?1 function enhances susceptibility to gastric preneoplastic transformation：研究人员分析E955A?KI小鼠胃黏膜发现自发化生病变比例略增且重度组织学评分更多。经口灌胃他莫昔芬诱导SPEM后，E955A?KI小鼠病变严重程度高于野生型(wild?type, WT)；DMP?777处理下WT仅出现局灶轻度病变，而KI小鼠出现广泛黏膜损伤、异型腺体扩张及更高评分，说明功能性EMILIN?1是限制上皮转化和维持组织架构所需。E955A?KI小鼠在DMP?777处理后黏膜α?SMA和粘膜肌层(muscularis mucosae)厚度呈上升趋势。人胃异型增生组织中EMILIN?1在正常黏膜存在而在异型增生区缺失，α?SMA未同步升高，α₉整合素在两者间无明显差异，提示EMILIN?1丢失是极早期事件，早于完全成纤维细胞重编程；高EMILIN?1表达GC患者总生存(overall survival, OS)和无进展生存期(first progression, FP)更长，ITGA9在肿瘤中显著降低，而ITGA4因炎症细胞混杂在整体组织中未见显著差异。

讨论部分总结：研究人员指出本研究揭示了GC细胞通过双重损害EMILIN?1/整合素轴重编程TME的新机制，EMILIN?1作为关键基质“看门人”抑制上皮转化和成纤维活化，其缺失形成促肿瘤生态位。E955A?KI小鼠易感性增加及人异型增生中EMILIN?1选择性丢失说明基质改变是GC进展的早期主动事件而非被动后果。GC细胞通过可溶性因子主动抑制基质EMILIN?1转录，该过程具有GC特异性和选择性，不涉及广泛ECM降解。EMILIN?1缺失损害LEC功能并促进成纤维细胞向肌成纤维/CAF样活化，伴随AKT、ERK、NF?κB、STAT3激活及CTGF升高，可能通过破坏机械传导和促炎促存活级联驱动基质重编程，且活化成纤维细胞可能进一步影响LEC。人异型增生中α?SMA未显著增加及α₉整合素未下调支持EMILIN?1丢失为极早期事件，整合素重塑可能为更晚阶段特征。综上，EMILIN?1是胃TME中枢节点，肿瘤靶向抑制其表达属于“基质劫持”策略。临床上恢复EMILIN?1功能、防止其降解或再激活整合素信号可重建基质控制，结合对其表观或翻译后调控的解析可为GC提供微环境导向的新干预靶点。

结论部分原文翻译：研究结果确立EMILIN?1为胃组织完整性的关键调节因子。其缺失通过破坏上皮稳态、损害淋巴管结构和促进成纤维细胞活化，形成促肿瘤微环境。EMILIN?1在早期人异型增生中持续降低，凸显其作为早期GC风险分层的新型基质生物标志物的潜力。此外，恢复EMILIN?1/整合素轴是重建生长控制和抑制肿瘤进展的有前景的治疗策略。

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