《Small》：Self-Organized Vascularized Human Liver Spheroids: Serum-Free Culture Conditions and Use as Tissue Building Blocks
编辑推荐：
工程化具备血管化特征的人肝组织用于体外与体内应用仍是一项重大挑战。在此，研究人员描述了一种可扩展的方法，用于生成带有自组织、含腔（lumen-containing）血管网络的人肝球体，并证明其作为构建单层及多层组织结构的构建单元（building blocks
工程化具备血管化特征的人肝组织用于体外与体内应用仍是一项重大挑战。在此，研究人员描述了一种可扩展的方法，用于生成带有自组织、含腔（lumen-containing）血管网络的人肝球体，并证明其作为构建单层及多层组织结构的构建单元（building blocks）的用途。球体由HepaRG肝细胞、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）及脂肪组织来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）聚集形成。在特定比例中纳入后者可防止肝细胞与内皮区室发生空间分离，从而促成内皮网络的形成。研究人员提出了两种用于培养此类球体的培养基：一种血清减量（serum-reduced）培养基，以及一种含有Gibco KnockOut Serum Replacement的定义明确的无血清（serum-free）培养基。这些培养基支持肝细胞以维持代谢活性、相对成熟的状态长期存活，并维持内皮网络的持续性。球体来源的内皮细胞在微流控装置中与外部内皮通道建立吻合（anastomoses），并且在植入小鼠肝组织后延伸至宿主实质（parenchyma）。此外，从球体萌发的內皮芽（endothelial sprouts）在许可性水凝胶（permissive hydrogels）内形成球体间连接，该过程取决于球体间距离。最后，研究人员展示了具有血管互连球体的平面组织层制备，以及由若干此类层创建的宏观尺度组织构建物。
该研究发表于《Small》。当前实验室生成的人肝组织常规应用受限于缺乏血管系统以及可扩展性不足等问题。血管系统对于组织稳态、药物递送及超越氧扩散极限的组织存活至关重要，而单细胞生物打印速度过慢难以满足临床规模需求，因此亟需开发可作为组织构建单元且具备预血管化能力的可控三维（three-dimensional, 3D）球体。为此，研究人员开展了自组织血管化人肝球体的可扩展生成研究，探究特定细胞比例、无血清培养条件对其结构与功能的影响，并验证其作为构建单元组装宏观组织的能力。
为开展研究，研究人员主要采用的关键技术方法包括：利用琼脂糖微孔板进行肝细胞（HepaRG）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs, 带GFP标签）与脂肪源间充质干细胞（MSCs）的三细胞共聚球体制备；开发血清减量（EH 2%FCS）与含KnockOut Serum Replacement的无血清（EH 4%SR）复合培养基；将球体嵌入纤维蛋白、FibAgGel及CollMet等多种水凝胶评估出芽；利用微流控芯片（idenTX3）评估球体来源内皮细胞与外部通道的吻合能力；通过小鼠肝脏离体移植模型观察体内浸润；采用石蜡与冰冻切片进行免疫荧光、免疫组化（periodic acid-Schiff staining, PAS）及透射电镜（transmission electron microscopy）表征；利用共聚焦显微镜结合Imaris软件进行三维血管网络重构与定量；通过ELISA、尿素测定及细胞色素P450家族3亚家族A成员4（cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4, CYP3A4）活性检测评估肝功能；借助RT-qPCR分析肝与内皮特异性基因表达；利用负压硅胶模具铸造交联明胶微孔阵列实现球体定距平面排布与多层聚乙醇酸（polyglycolic acid, PGA）膜支撑的多层组织构建。
3.1 Mesenchymal Stem Cells Facilitate Endothelial Cell Network Formation Within Human Liver Cell Spheroids
研究人员通过设置不同HepaRG与GFP-HUVEC双细胞比例发现两者会发生空间分离，HUVEC聚集中部；引入MSCs后以不同比例（HepaRG:GFP-HUVEC:MSC为5:2:2与5:2:4等）共聚，证实MSCs能阻止分隔并促进网络状内皮结构形成，确定5:2:2为最优比例以兼顾肝细胞占比与血管网络。
3.2 Vascularized Liver Spheroid Growth is Influenced by Cell Culture Medium Composition
研究人员对比ECGM2 2%FCS、EH 2%FCS及EH 4%SR三种培养基，发现ECGM2 2%FCS中球体面积随时间减小且增殖受限；EH 2%FCS与EH 4%SR均支持更大投影面积、更高Ki67阳性增殖细胞与E-cadherin阳性HepaRG细胞比例及广泛血管样网络，且EH 4%SR在无动物血清下未损害结构与功能完整性。
3.3 Vascularized Liver Spheroids Exhibit Characteristics of Human Liver Tissue and can be Maintained in Culture for 3 Weeks
研究人员将球体在EH 2%FCS与EH 4%SR中培养至14及21天，通过PAS染色、perilipin 2免疫组化证实存在代谢活跃较成熟肝细胞索与脂滴；RT-qPCR显示肝细胞特异性基因（HNF4A, ALB, CYP3A4, GLUL, ASGR1）及转运蛋白基因（SLC10A1, SLCO2B1, ABCC2, SLC2A2）表达稳定；功能实验显示尿素分泌、白蛋白（albumin）产生及CYP3A4活性与单纯HepaRG球体相当，证明可长期维持肝功能。
3.4 Endothelial Cells form Structures Resembling Microvessels Within Liver Spheroids
研究人员通过透射电镜观察到扁平内皮细胞借黏附连接构成典型毛细血管形态，RT-qPCR检出ICAM1、PECAM、CDH5表达；共聚焦全mount染色抗VE-cadherin显示内部互连血管网，三维定量分析示血管体积分数约1.4%，平均管腔直径5.34±0.48 μm（EH 2%FCS）与5.65±0.66 μm（EH 4%SR），最大达11 μm级；免疫荧光示HUVEC嵌于vimentin阳性MSCs层间，ICAM-2证实管腔存在。
3.5 Endothelial Cells from Liver Spheroids form Anastomoses with External Endothelial Cells
研究人员在微流控芯片中将含GFP-HUVEC球体嵌入纤维蛋白，侧通道载入RFP-HUVEC，发现35.7%（EH 2%FCS）与26.9%（EH 4%SR）球体与主血管建立吻合且可被1 μm荧光微珠灌注；移植至小鼠肝外植体后GFP-HUVEC向宿主实质延伸并自组织为血管样结构。
3.6 Vascular Structures Formed Within the Triple-Cell Liver Spheroids Extend into Mouse Liver Tissue Upon Grafting
研究人员将4日龄三细胞球体注射入出生后0天小鼠肝外植体，在1及2天后观察见球体来源GFP-HUVEC持续自组织为向宿主实质延伸的血管样结构，证实其与天然组织微环境的兼容性。
3.7 Liver Spheroids as Building Blocks for the Formation of Larger Vascularized Tissue
研究人员将球体随机嵌入纤维蛋白、CollMet、FibAgGel中，纤维蛋白与CollMet出芽率最高且依赖许可距离（205–1075 μm，小于200 μm无出芽）；MSCs先迁移引导内皮出芽。利用转谷氨酰胺酶交联明胶微孔阵列定距（横竖839±34 μm，对角982±20 μm）排布球体并于纤维蛋白桥接，5–7天现芽、9–13天邻球GFP-HUVEC融合互连，芽长~650 μm且无介质差异。进一步在多孔聚乙醇酸（PGA）膜上铸凝胶层，培养一周后堆叠三层构造，冰冻切片示各层均含白蛋白阳性与Ki67阳性细胞，证明可用血管化球体模块化构建宏观组织。
讨论部分总结：研究人员指出本研究明确了多细胞共聚自组织形成血管化人肝球体的关键参数，包括特定MSCs比例防分隔、5:2:2细胞比、血清减量及无血清（含KnockOut Serum Replacement）培养基维持肝与内皮表型，并在体外实现具超微结构毛细血管特征含管腔的内皮网络。相较既往仅移植后成腔的研究，本工作在体外达成并获电镜证据。肝细胞占比（57%–68%）高于部分文献，肝功能未因血管化受损。研究发现球体间距是血管互连关键，过近（<200 μm）无出芽，MSCs起导向作用，挑战了紧密堆积构建策略，强调精确定距与空间功能化的重要性。所提明胶微孔联合PGA膜的平面与层叠构建法可分开培养监控再堆叠，加速宏观组织制造。该方案或可推广至其他器官球体（特异细胞+内皮+间质），未来需纳入免疫细胞及评估体外灌注性与体内移植存活。
研究结论翻译：血管化人肝球体在肝脏学领域具巨大潜力：可作为研究肝病、评估物质毒理与开发药物的组织模型，亦可作构建单元快速制造更大组织单位以替代或支持丧失或失功的人肝组织。本研究明确了不同细胞类型聚集成球时在时空上同步自组织形成血管化人肝组织的关键影响参数，并提出新方法通过在球体间创造成管条件与逐层制造，从球体形成更大连续血管化组织结构。本研究概述了长期培养自组装血管化肝球体的关键要求：（i）特定比例纳入间充质细胞防肝与内皮空间分隔并促网络；（ii）5:2:2（HepaRG:GFP-HUVEC:MSC）比例致一致血管化球且肝细胞占比高；（iii）确定兼顾各细胞类型的通用培养基（EH 2%FCS与EH 4%SR）使HepaRG源性肝细胞呈代谢活跃较成熟表型；（iv）该条件支持具成腔潜能的内皮网，并鉴定出具毛细血管超微特征的内皮结构。基于结果，所述方法可作模板生成含器官特异细胞、内皮与间质的其它人球体，即用内皮与器官特异细胞基础培养基1:1混合加全量添加剂并以KnockOut Serum Replacement替FCS。球体生成维护无需额外细胞外基质或水凝胶且易扩展。多数以球体为构建单元的研究聚焦窄间距促融合，但血管化球体过近间距不利，球体间距是血管互连关键因素，过近无法建立互连，与Kim等一致显示MSCs似为内皮向外生长的导向线索。这挑战了紧密堆积目标，强调需自动技术精确定距，亦可能功能化球间空间（如生物材料或支持细胞）促血管整合与功能，针或微针（Kenzan）组装法亦可借间距洞察促互连。任一法留球间空间减所需球数，预制成球凝胶层加速制造，最终使模块间留空可构细胞密度近原生器官的组织。研究人员提供的方法产具血管连通肝球体的组织层，即将预制球嵌入带腔水凝胶层（速由印章制），并以可降解PGA膜为底稳面促简易逐层制造；优势是可分开创建监控各血管层待互连后再堆叠。多细胞自组织成血管肝球体结合此法可增强工程构建物体外存活并启新制造途径。未来应探索在本方案内球内或球间纳入免疫细胞，并评估此法构件的体外灌注性。对于依赖植入迅速血管化的体内应用，所示人球源性内皮结构向生理微环境延伸能力及血管互连组织块法，或可改善球体或类器官构建移植组织的存活。
