声学镊子辅助培养皿中生物材料模塑（TAMP）用于工程化具有受控细胞和细胞外基质结构的胶质瘤组织

《Small》：Acoustic Tweezers-Assisted Biomaterial Molding in Petri Dishes (TAMP) for Engineering Glioma Tissues With Controlled Cellular and Extracellular Matrix Architectures

　　

组织工程已显示出在制造组织替代物和开发生理相关组织模型方面的巨大潜力。然而，传统的组织工程策略在同时制备具有受控细胞和细胞外基质（ECM）结构的组织时常常面临挑战。在此，研究人员介绍了一种声学镊子辅助培养皿中生物材料模塑（TAMP）技术，该技术能够在培养皿中制备具有受控细胞和ECM结构的组织，具体而言，可生产具有定制化ECM几何形状和多种内部细胞结构的构建体，包括平行排列的细长细胞束、相互连接的细胞球体阵列以及网格状细胞网络。TAMP利用一个便携式声学阵列，将驻波传递到培养皿或聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中，从而实现独特的“双控制”机制。声场将内部细胞排列成平行线状和网格状图案，而PDMS模具则定义整体的ECM几何形状。研究人员通过在不同形状的模具内将微米级物体排列成各种图案，并制备具有多种独特内部细胞结构的胶质瘤组织（包括平行排列的细长胶质瘤组织束、网格状胶质瘤组织网络以及相互连接的胶质瘤球体链）来验证该方法。研究人员预计，TAMP技术将催生便携式、易于操作的工具，用于工程化具有受控细胞和ECM结构的组织，以应用于生物医学研究、疾病模型构建和药物测试。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
组织工程在再生医学、疾病模型构建和药物筛选等领域具有巨大潜力，理想的人造组织应同时模拟天然组织的细胞外基质（ECM）结构和细胞架构，因为这些结构对再现组织的材料特性、力学行为和生理功能至关重要。然而，现有组织工程策略（如纳米拓扑、机械拉伸、生化信号及电磁场）在同时控制细胞和ECM结构方面存在挑战：微槽基底法耗时且需定制基底；机械拉伸难以集成到初始制造过程且无法生成复杂细胞结构；磁控技术需外源性标记颗粒，可能影响细胞活力和表型，且难以精确控制磁场图案。声学技术虽已用于细胞排列（如神经、肌肉、心脏和血管组织），但缺乏便携易用、可直接在培养皿中操作、同时控制ECM几何形状和内部细胞排列的装置，且尚未用于胶质瘤组织建模。为解决这些问题，研究人员开发了培养皿中声学镊子辅助生物材料模塑（TAMP）技术。

**研究内容与结论**
研究人员提出了一种名为TAMP的声学辅助组织工程方法，利用便携压电换能器阵列在培养皿中产生驻波，结合PDMS模具实现“双控制”机制：模具定义整体ECM几何形状，声场控制内部细胞排列。通过改变换能器配置和输入信号，可生成平行线状、网格状等细胞图案，并制造出具有平行细长细胞束、网格状网络和相互连接球体链等独特结构的胶质瘤组织。实验表明，TAMP能有效排列细胞且保持高活性（>90%），初始声学排列促进细胞束形成，长度可达2911.1 μm，超过以往研究。此外，还实现了网格状细胞网络和球体环/链的构建，并验证了定向细胞间小分子传输。该研究发表在《Small》。

**关键技术方法**
TAMP平台由玻璃底培养皿、定制PDMS模具、围绕培养皿的压电换能器阵列、超声耦合层（去离子水）及3D打印固定器构成。使用有限元声-结构相互作用模拟分析声场传播，通过Gor'kov势预测辐射力分布。采用U251胶质瘤细胞系（来源：弗吉尼亚理工大学生物医学工程系）进行细胞实验，结合免疫荧光染色（GFAP）、活/死活性检测、共聚焦成像及多维傅里叶变换方向性分析评估组织结构。关键步骤包括：胶原-细胞溶液制备后在冰上操作，激发换能器约5分钟使细胞在胶原凝胶化过程中排列，随后培养形成组织。

**研究结果**

**2.1 Mechanisms of TAMP**
通过示意图和实验装置说明TAMP工作原理：压电换能器产生的声波经耦合层和培养皿底部传入胶原-细胞溶液，形成驻波，压力节点处捕获细胞并排列成线状或网格状图案。PDMS模具决定水凝胶几何形状，换能器配置和激发频率控制内部细胞图案。温度轻微上升（约23°C升至26.7°C）加速胶原凝胶化，不影响细胞活性。

**2.2 In-Petri-Dish and In-Mold Cell Patterning**
通过有限元模拟和实验验证声波通过玻璃底培养皿的有效传输。单对换能器激发时，细胞沿平行压力节点线排列，间距随频率增加而减小（3.2 MHz时248 μm，7.5 MHz时106 μm）；两对正交换能器激发时，细胞在网格状势阱中聚集形成簇，改变频率可调节簇间距和大小。在PDMS模具（圆形、六边形）内也能成功排列微球（Fe₃O₄），验证了模具内声学图案化能力。

**2.3 Fabrication for Oriented Collagen-Matrix Glioma Tissues**
使用单对换能器制造平行排列的胶质瘤细胞束。活/死染色显示声波处理24和48小时后细胞活性>90%。培养3天后，声学组细胞沿排列方向伸长，形成定向束，傅里叶变换频谱在90°和270°方向显示高强度斑点，表明整体方向性；对照组细胞随机分布。免疫荧光染色（GFAP）显示，第3天声学组形成多条长且定向的细胞束，第7天出现更多更长突起，部分连接相邻束，形成网络。

**2.4 3D Architecture and Physical Connections in Oriented Glioma Tissues**
共聚焦成像显示平行束为3D结构，细胞密集排列，GFAP阳性突起沿束轴向延伸。沿束轴向的强度分布显示高密度细胞，垂直方向强度峰间距（146 μm）与半波长一致。束宽度（平均50.6 μm）显著大于对照组（平均32.4 μm），束长度范围642–2911.1 μm（平均1510.3 μm），超过以往研究。

**2.5 Lattice-Like Tissue Networks and Interconnected Spheroid Arrays**
使用两对60°交叉换能器制造网格状组织，共聚焦图像显示两个方向（90°和150°）的细胞束相互连接，形成3D网络。使用两对正交换能器制造细胞球体阵列，培养3天后球体伸出突起，连接相邻球体形成环状网络或长链（最长约975 μm，球体直径123.7±58.1 μm）。此外，利用Calcein-AM标记的NIH3T3成纤维细胞进行小分子转移实验，显示荧光沿细胞束方向随时间扩散，证明定向细胞间通信。

**讨论与结论**
讨论部分指出，TAMP相较于磁场辅助方法（需标记颗粒）具有无标记优势；相较于光镊，操作简单且可扩展；相较于其他声学方法，便携且兼容培养皿，同时控制ECM和细胞结构。TAMP填补了胶质瘤声学组织工程的空白，制造的细胞束、网络和球体链为研究细胞间信号传导、集体侵袭和药物响应提供了模型。结论部分翻译如下：
本研究提出了一种声学辅助组织工程方法——TAMP，可直接在常用培养皿中制造具有可控细胞架构和组织几何形状的结构化组织，例如具有定制整体形状和多种内部细胞结构（如细长平行细胞束、相互连接的球体阵列和网格状互联细胞网络）的组织构建体。TAMP利用围绕培养皿的便携式、易用、可重构声学阵列，将声波传递到培养皿内的PDMS模具中，以排列模具内预加载溶液中的细胞分布。该功能通过独特的“双控制”机制实现TAMP组织制造：PDMS模具物理定义整体组织几何形状，而声波调节内部微观细胞架构。通过使用不同形状的PDMS模具，可制造具有不同整体几何形状的组织；通过调节声学阵列输入信号和/或改变压电元件排列以修改产生的声场，可实现多种内部细胞排列，包括平行线状和网格状细胞图案。研究人员通过实验验证了TAMP能够制造平行细长胶质瘤组织束、网格状胶质瘤组织网络以及相互连接的胶质瘤球体环和长链。这些结构化胶质瘤组织可能有助于研究球体间信号转导、胶质瘤细胞间通信和集体侵袭。TAMP技术有望推动便携式、易用、多功能声学平台的开发，用于制造具有高度可定制ECM几何形状和内部细胞架构的仿生组织，应用于生物医学研究、疾病模型和药物测试。