星形胶质细胞TNFR1缺失减轻过度兴奋性和癫痫发生的启动

《GLIA》：Deletion of Astrocytic TNFR1 Attenuates Hyperexcitability and Initiation of Epileptogenesis

　　

颞叶癫痫（TLE）是成人中最常见的局灶性癫痫，对当前医学治疗高度耐药。细胞因子信号，包括通过肿瘤坏死因子-α（TNFα）的信号，不仅被认为是伴随因素，而且还是疾病启动的关键方面。TNFα通过其在星形胶质细胞中的1型受体（TNFR1）控制海马中的兴奋性回路，但尚不清楚这一星形胶质细胞通路是否特异性地促进癫痫。在此，研究人员使用条件性细胞特异性敲除小鼠系，选择性地在星形胶质细胞中诱导TNFR1缺失，并测试其在TLE启动和进展中的作用。缺乏星形胶质细胞TNFR1的小鼠表现出降低的基础谱功率，在红藻氨酸处理后首次癫痫发作的潜伏期更长，并且在4周后表型较轻。因此，消除星形胶质细胞TNFR1信号可能对TLE有益，并可能为该疾病提供新的治疗靶点。

**论文解读：星形胶质细胞TNFR1在颞叶癫痫发生中的关键作用**

**研究背景与问题**
癫痫是一种以反复自发性发作为特征的神经系统疾病，影响全球约1%的人口。其中，颞叶癫痫（TLE）是成人最常见的局灶性癫痫类型，且常对现有药物治疗耐药。近年来，脑部炎症在癫痫病理生理中的作用受到广泛关注。炎症介质如细胞因子、趋化因子等不仅驱动局部炎症，还作为神经调质影响神经元功能和兴奋性。特别是，促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNFα）在正常生理条件下对突触回路具有重要调节功能，但在病理状态下其水平升高可导致突触功能障碍。TNFα通过两种受体发挥作用：1型受体（TNFR1）和2型受体（TNFR2）。TNFR1广泛表达于中枢神经系统（CNS）多种细胞类型，主要被可溶性TNFα激活，并含有死亡结构域，可诱导凋亡或坏死性凋亡；而TNFR2主要存在于免疫细胞，优先被跨膜TNFα激活，促进细胞存活和免疫调节。既往研究表明，TNFα信号在癫痫的发生发展中起重要作用，但星形胶质细胞TNFR1是否特异性地参与癫痫的发生和进展尚不明确。因此，研究人员开发了条件性星形胶质细胞特异性TNFR1敲除小鼠，以探究该受体在TLE启动和进展中的具体贡献。

**研究内容与结论**
研究人员通过他莫昔芬（TAM）诱导的Cre/loxP系统，在星形胶质细胞中特异性删除TNFR1（TNFR1^GFAP-KO），并利用两种红藻氨酸（KA）诱导的癫痫模型——系统性KA注射模型（急性癫痫）和皮层内KA注射模型（慢性TLE伴海马硬化，TLE-HS）——结合脑电图（EEG）记录、免疫组化、缝隙连接偶联测量等技术，系统评估了星形胶质细胞TNFR1缺失对癫痫发生和进展的影响。研究发现，星形胶质细胞TNFR1缺失显著减轻了急性癫痫发作的严重程度（延迟首次发作、缩短发作持续时间），并降低了基础EEG谱功率，表明整体回路兴奋性降低。在慢性TLE-HS模型中，星形胶质细胞TNFR1缺失减轻了癫痫持续状态（SE）的严重性，减少了慢性期棘波频率和EEG功率，并减轻了海马硬化（HS）的病理改变（包括神经元丢失减轻、颗粒细胞分散减少、星形胶质细胞增生减弱）。机制上，星形胶质细胞TNFR1缺失阻止了KA诱导的缝隙连接偶联丧失，而缝隙连接偶联的维持有助于K⁺缓冲和谷氨酸稳态，从而抑制过度兴奋。该研究首次提供实验证据表明，星形胶质细胞TNFR1信号直接参与神经元过度兴奋和癫痫发生，并可能成为TLE（包括耐药型）的新治疗靶点。论文发表在《GLIA》。

**关键方法**
研究人员使用了条件性星形胶质细胞特异性TNFR1敲除小鼠模型（TNFR1^GFAP-KO），通过TAM（他莫昔芬）诱导Cre重组酶活性，实现星形胶质细胞中TNFR1缺失和tdTomato报告基因表达。在系统性KA模型中，小鼠经皮下注射KA（10 mg/kg），通过植入皮层和海马的EEG电极进行视频EEG记录，分析急性发作参数（潜伏期、发作次数、持续时间）及EEG谱功率。在皮层内KA模型中，小鼠接受立体定位单侧皮层内KA注射，并植入遥测EEG发射器，连续记录4周。通过全细胞膜片钳结合生物胞素填充，在急性脑片中对海马CA1区星形胶质细胞进行缝隙连接偶联测量。免疫组化分析海马硬化指标，包括神经元计数（NeuN）、颗粒细胞层宽度、CA1辐射层萎缩、星形胶质细胞增生（GFAP）和小胶质细胞反应（Iba1）。样本来源：小鼠品系由George Kollias教授赠予的TNFR1^fl/fl小鼠与GFAP^CreERT2tdTomato^lsl/lsl小鼠杂交获得。

**研究结果**
**3.1 星形胶质细胞TNFR1缺失和tdTomato报告基因表达的诱导**
通过免疫组化和基因组PCR确认，TAM处理后的TNFR1^GFAP-KO小鼠在海马CA1辐射层和齿状回分子层分别有48.47%±3.68%和60.24%±4.28%的GFAP阳性细胞发生重组，且重组仅限于星形胶质细胞，未在神经元、少突胶质细胞或小胶质细胞中观察到。

**3.2 星形胶质细胞TNFR1缺失减轻皮下KA注射诱导的急性癫痫发作**
EEG记录显示，与对照组相比，TNFR1^GFAP-KO小鼠首次KA诱导癫痫发作的潜伏期显著延长，总发作时间和平均发作持续时间显著降低，但发作次数无显著差异，表明星形胶质细胞TNFR1缺失赋予对KA致痫作用的部分抵抗。

**3.3 星形胶质细胞TNFR1缺失降低基础EEG谱功率**
基础状态下，TNFR1^GFAP-KO小鼠的总EEG谱功率及δ、θ、α频段功率显著低于对照组，而在KA给药后，两组间归一化功率无差异，提示星形胶质细胞TNFR1缺失导致整体回路兴奋性降低，从而延迟发作并缩短发作持续时间。

**3.4 星形胶质细胞TNFR1缺失减轻TLE-HS小鼠模型中癫痫持续状态的严重性**
在皮层内KA注射模型中，TNFR1^GFAP-KO小鼠在SE的1小时内，发作持续时间与总发作时间显著减少，棘波频率降低，但发作次数与EEG总功率无差异，表明星形胶质细胞TNFR1缺失减轻了SE的严重程度。

**3.5 星形胶质细胞TNFR1缺失减轻慢性癫痫活动和HS发展**
经过相等的潜伏期后，所有TNFR1^GFAP-KO小鼠和87.5%的对照组小鼠发展为慢性自发性全身性发作（SGS）。虽然SGS频率和持续时间无差异，但TNFR1^GFAP-KO小鼠的棘波频率和EEG功率（包括总功率和多个频段）显著降低，表明慢性癫痫活动减轻。组织学分析显示，TNFR1^GFAP-KO小鼠的HS病理改变较轻，包括CA1区神经元丢失减少、颗粒细胞分散减轻、星形胶质细胞增生减弱，但辐射层萎缩和小胶质细胞反应无差异。

**3.6 星形胶质细胞TNFR1介导癫痫诱导的缝隙连接偶联丧失**
在KA注射后4小时，对照组小鼠的CA1辐射层星形胶质细胞缝隙连接偶联降低了50%以上，而TNFR1^GFAP-KO小鼠的偶联未受影响，且对侧偶联也优于对照组。非癫痫条件下，两组偶联效率无差异，表明星形胶质细胞TNFR1是KA诱导的缝隙连接偶联丧失的关键介导因子。

**讨论与结论**
讨论部分指出，TNFα在健康脑中维持低水平，对突触可塑性和神经传递至关重要，而星形胶质细胞TNFR1信号在生理条件下调节神经元同步化（基础EEG功率降低证实）。在癫痫病理中，TNFα升高通过激活星形胶质细胞TNFR1导致缝隙连接偶联丧失和谷氨酸能胶质传递失调，从而促进过度兴奋和癫痫发生。星形胶质细胞TNFR1缺失通过维持偶联和降低回路兴奋性，减轻了急性和慢性癫痫活动及海马硬化。该研究结论翻译如下：
**结论**：神经炎症细胞因子TNFα此前已被认为与癫痫病理生理相关，但TNFR1与TNFR2激活的二分性、表达TNFR的细胞类型多样性以及TNFR下游信号的复杂性掩盖了该细胞因子在疾病发生中的确切作用。本研究提供了TNFα在癫痫中作用的新见解，并确定星形胶质细胞TNFR1信号是癫痫发生的关键介质。研究人员证明，在两种不同的癫痫模型中，可诱导的星形胶质细胞特异性TNFR1缺失通过减轻和延迟急性癫痫活动来缓解癫痫的启动，提供了跨模型证据表明其参与过度兴奋性的产生。此外，在成熟的TLE-HS小鼠模型中，它减轻了慢性癫痫样活动和特征性组织病理学改变。机制上，星形胶质细胞特异性TNFR1缺失不仅降低了生理条件下的基础EEG谱功率，而且在皮层内KA诱导的SE期间保持了星形胶质细胞缝隙连接偶联。这两个现象对观察到的急性和慢性癫痫样活动减弱的时空贡献及其精确分子机制仍有待阐明。此外，尽管观察结果一致，但鉴于系统性KA和皮层内KA模型之间存在显著差异（包括短期和长期组织病理学、发作表现和行为表现），研究人员的结果在推断至人类TLE时需谨慎。尽管如此，研究结果将星形胶质细胞TNFR1的异常信号置于癫痫发生和癫痫易感性的更广泛背景下，从而确定了星形胶质细胞TNFR1作为局灶性癫痫（包括对当前治疗耐药的形式）的新潜在药物靶点。