2型细胞因子生物标志物高和低的重症哮喘的气道转录组

《Allergy》：The Airway Transcriptome in Type 2 Cytokine Biomarker-High and -Low Severe Asthma

　　

重症哮喘是一种异质性疾病。当2型（T2）细胞因子活性被抑制时驱动气道病理的机制仍然知之甚少。本研究旨在通过识别T2生物标志物高和低的重症哮喘的气道分子通路来提供见解。研究人员分析了来自英国难治性哮喘分层计划多中心重症哮喘队列的支气管活检和刷检的临床和转录组数据（18例皮质类固醇抵抗的T2生物标志物高[T2-high]，23例T2生物标志物中间[T2-intermediate]，11例T2生物标志物低[T2-low]）以及20例健康对照在高剂量吸入性皮质类固醇（ICS）治疗前后的数据。许多在哮喘与健康对照中差异表达的基因在接受ICS的健康受试者中一致地差异表达。重症哮喘整体，独立于ICS的混杂效应，以粘蛋白、CEACAM5、典型T2基因（POSTN、CLCA1、CCL26）、上皮肥大细胞基因和CPA4的上调为特征。T2-high重症哮喘表现出上调的T2依赖性基因、上皮屏障和角蛋白基因、适应性免疫反应以及受损的纤毛功能。T2-low哮喘表现出上调的Th1-和IL-17相关基因（IDO1、CXCL10、GBP1、LAG3）、干扰素-γ信号、神经免疫通路、气道平滑肌相关基因和中性粒细胞富集。T2-intermediate哮喘表现出混合的分子特征，共享T2-high和T2-low内型的特征，并选择性表达病原体防御和抗病毒反应基因。结果使用U-BIOPRED联盟的支气管镜数据进行了验证。本研究定义了与T2生物标志物高和低表型相关的重症哮喘的气道分子内型，独立于皮质类固醇效应。这些发现为重症哮喘的管理和靶向生物疗法的开发提供了见解。

**研究背景与问题**
重症哮喘影响全球2.6亿至3.5亿人，约10%的患者对现有治疗（包括吸入性皮质类固醇（ICS））表现出抵抗性，且医疗成本显著增加。哮喘是一种异质性疾病，其病理特征包括气道高反应性（AHR）、可变气流阻塞、气道炎症、黏液过度分泌、气道重塑（上皮功能障碍、黏液腺增生、气道平滑肌（ASM）质量增加）。然而，这些病理要素与分子通路之间的关系，以及不同临床表型背后的分子机制，尚不明确。尤其是对于非T2型（T2-low）重症哮喘，其对ICS和T2靶向生物制剂（如抗IL-4Rα、抗IL-5/IL-5Rα、抗TSLP）反应不佳，其分子机制仍不清楚。既往研究存在三个主要混杂因素：依从性差导致表型评估不准确、症状导向治疗导致ICS过度使用（尤其在T2-intermediate或T2-low患者中）、以及使用未接受ICS的健康对照作为比较组，无法区分哮喘免疫病理与治疗性ICS引起的分子变化。为解决这些问题，本研究纳入经客观验证依从性的参与者，并使用FeNO抑制试验区分皮质类固醇敏感与抵抗性T2-high疾病，同时纳入接受高剂量ICS的健康对照，以消除ICS混杂效应。研究旨在表征无ICS混杂的重症哮喘气道转录组，并探索T2生物标志物谱两端的特征，以定义皮质类固醇抵抗性T2-high、T2-intermediate和T2-low重症哮喘的关键分子特征。该论文发表在《Allergy》。

**技术方法**
研究采用英国难治性哮喘分层计划（RASP）多中心重症哮喘队列的支气管活检及刷检样本，包括52例患者（18例T2-high、23例T2-intermediate、11例T2-low）以及莱斯特健康志愿者研究（HVS）的20例健康对照（接受高剂量丙酸氟替卡松500 mcg每日两次，共4周，治疗前后均有活检）。主要关键技术包括：批量RNA测序（bulk RNA-seq）获得转录组数据；差异表达分析使用DESeq2（Benjamini–Hochberg FDR校正<0.05，log2FC±≥0.5视为生物学相关）；非参数秩积分析（RPA）验证稳健性；基因本体论（GO）富集分析、基因集富集分析（GSEA）、基因集变异分析（GSVA）评估通路水平变化；加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别表型相关模块；转录因子（TF）活性推断使用DoRothEA数据库；基于Travaglini单细胞图谱的参考细胞去卷积估计细胞亚群比例。验证队列采用U-BIOPRED联盟的支气管镜数据（微阵列分析）。

**研究结果**
3.1 临床特征：T2-high组FeNO和血嗜酸性粒细胞显著高于其他组，T2-low组年重度急性加重次数和急诊就诊次数较高。
3.2 哮喘与未接受ICS健康对照的差异表达基因分析：在支气管活检中，哮喘组多数基因下调（755个下调，192个上调，log2FC±≥1.5），上调基因包括经典T2炎症基因（CLCA1、CCL26、CEACAM5）、粘蛋白MUC6、AREG等。刷检中以上调为主（214个上调，72个下调），包括T2相关胱抑素（CST1/2/4）、FETUB、PPBP等。GO分析显示上皮屏障功能障碍、黏液过度分泌、组织重塑和免疫通路抑制。
3.3 调整ICS混杂效应后的哮喘差异表达基因：与接受ICS的健康对照相比，哮喘组活检中993个基因上调、536个下调；刷检中638个上调、404个下调。共同上调基因包括MUC5AC、SYNCRIP、CEACAM5、CPA3、CLDN2等。RPA确认MUC5AC、POSTN、IL33、ITGB8等显著上调。下调基因包括SCGB1A1、SCGB3A1、HIF3A、SST。GO分析显示适应性黏膜免疫富集，下线粒体功能通路下调。GSEA显示哮喘与T细胞刺激肥大细胞、IFNα刺激树突状细胞、病毒刺激免疫细胞通路相关，免疫调节T细胞通路抑制。
3.4 哮喘表型间差异表达基因分析：GSVA显示T2评分在T2-high至T2-low呈“剂量-反应”趋势，IL-17评分在T2-low刷检中显著升高。ICS反式激活/反式抑制基因签名在T2表型间组中位数相似，但个体间变异大。
3.5 与关键炎症生物标志物相关的转录组特征：血嗜酸性粒细胞和FeNO共享许多基因（如CCL26、MMP1），但EDN2仅与嗜酸性粒细胞相关，POSTN、CST1仅与FeNO相关。嗜酸性粒细胞炎症基因（CXCL10、STC2）与中性粒细胞炎症基因（PRH2、SYT10）呈不同模式。
3.6 T2-high哮喘：与T2-low相比，活检中115个基因上调、38个下调，包括CST1/2/4、CLC、CLCA1、FETUB、POSTN、角蛋白基因（KRT1/4）、上皮屏障基因（PRB1/2、ROR1）、CTSG、NTKR2、CD36、CD44。RPA确认NOS2、MS4A2、CPA3、类胰蛋白酶等肥大细胞基因上调。GSEA显示B细胞和T细胞适应性免疫、1型干扰素信号活化，下调纤毛功能相关生物学过程。细胞去卷积预测NK细胞、基底细胞、杯状细胞增加。
3.7 T2-low哮喘：活检中Th1/IL-17相关基因（CXCL9、CXCL10、CSF3、CIITA）上调，ASM基因（RYR3、KCNA1、ACT2A）上调，表面活性蛋白上调。GSEA显示抗原处理、TCR激活、IFNγ信号、补体激活通路富集。纤毛功能相关GO过程（如“纤毛组织”、“纤毛运动”）相对上调。Treg和腺苷刺激肥大细胞签名富集。
3.8 T2-intermediate哮喘：与T2-high相比，少数基因上调，包括GBP1、C4A/C4B、CXCL10、IFIT3、BPFIA1（SPLUNC1）。GSEA显示髓系白细胞通路富集，病毒激活的中性粒细胞签名上调。细胞去卷积显示单核细胞、CD8 T细胞、嗜碱性/肥大细胞、巨噬细胞、NK细胞增加。
3.9 聚类分析和转录因子富集分析：K-means聚类识别6个基因簇，T2-high高表达C1（表皮发育）和C5（细胞质翻译），低表达C2（纤毛组织）；T2-low高表达C3（腺体发育、脂肪酸代谢）；T2-intermediate高表达C4（免疫介质、免疫球蛋白产生）和C6（白细胞迁移）。TF活性分析显示T2-high和T2-intermediate共同上调MYC、HIF1A、STAT1，T2-low特异性上调ATF3、ZBTB7A，T2-intermediate特异性上调NFKB1、TBX21、IRF1、IRF2、BATF、STAT2等。
3.10 U-BIOPRED队列验证：RASP与U-BIOPRED的log2FC在整体哮喘及T2表型比较中呈高度正相关，少数基因不一致。

**讨论与结论**
本研究的创新在于首次在无治疗性ICS混杂的情况下评估重症哮喘与健康对照的转录组差异。许多先前在哮喘中发现的差异表达基因在比较哮喘与ICS治疗健康对照时不再显著。重症哮喘的特征性上调包括MUC5AC、MUC2、典型T2基因及CEACAM5（后者可能作为药物靶点，如labetuzumab）。T2-high哮喘中纤毛基因通路显著抑制，而T2-intermediate或T2-low相对正常，推测与上皮化生（纤毛细胞被杯状细胞替代）、角蛋白改变及CEACAM5表达失调有关。T2-low哮喘上调神经免疫基因（SCG2、CALCA），提示CGRP等神经肽参与致病；CXCL10作为Th1和肥大细胞趋化因子，可能介导T2-low疾病。T2-intermediate哮喘并非简单的中间状态，而是具有独特的病毒激活签名、病原体防御模块和9种特异性转录因子，BPFIA1（SPLUNC1）显著上调，兼具抗炎和促炎作用。临床皮质类固醇不敏感在分子水平高度异质：T2炎症通路在T2-high患者中明显抵抗ICS，但多数基因仍保持ICS敏感性（如反式激活/反式抑制基因）。T2-low哮喘可能因既往嗜酸性炎症对ICS敏感而被抑制，残余疾病由ASM功能障碍、非T2驱动黏液表达和肥大细胞介质驱动。
**研究结论**：研究人员表征了三种主要重症哮喘表型，独立于治疗性皮质类固醇的混杂效应，识别出各自特有的基因集和通路。皮质类固醇抵抗性T2-high重症哮喘以T2-high基因、上皮肥大细胞基因、上皮屏障基因和角蛋白上调为特征；T2-low重症哮喘以Th1-和IL-17相关基因、神经免疫基因和ASM基因上调为特征；皮质类固醇反应性T2-intermediate重症哮喘以病原体防御、病毒激活、肥大细胞和NK细胞富集及六种特异性转录因子为特征。这些见解为识别这些研究较少的表型的新型治疗靶点提供了指导。