《Andrology》：Sperm Mitochondrial DNA Copy Number and Nuclear DNA Methylation Across Clinical and Non-Clinical Preconception Cohorts
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**背景**：精子线粒体DNA拷贝数（mtDNAcn）是男性生育力的新兴标志物，升高的mtDNAcn与不同人群的精液质量低下相关。精子DNA甲基化在体外受精（IVF）队列中也被证实与精液参数呈负相关。
**目的**：确定mtDNAcn是否与三个基于人群和临
**背景**：精子线粒体DNA拷贝数（mtDNAcn）是男性生育力的新兴标志物，升高的mtDNAcn与不同人群的精液质量低下相关。精子DNA甲基化在体外受精（IVF）队列中也被证实与精液参数呈负相关。
**目的**：确定mtDNAcn是否与三个基于人群和临床生育力队列中的核DNA甲基化相关。
**设计**：研究人员在748名男性中研究了精子mtDNAcn与全基因组DNA甲基化的关联，这些男性来自一个一般人群队列（LIFE；n=379）和两个不孕症队列（SEEDS；n=170和EARTH；n=199）。精子DNA甲基化和mtDNAcn分别通过Illumina EPIC（v1）芯片和三重探针数字PCR（dPCR）定量。在每个队列中进行协变量调整的线性回归，然后使用METAL进行荟萃分析。基因本体论（GO）分析探索差异甲基化CpG位点（DMC）和差异甲基化区域（DMR）的生物学相关性。
**结果**：使用Holm–Bonferroni显著性阈值，研究人员在LIFE、SEEDS和EARTH中分别鉴定出1351、224和258个DMC，以及2582、1536和1284个DMR，表明较高的精子mtDNAcn与DNA高甲基化相关。在荟萃分析中，576个DMC与mtDNAcn相关。值得注意的是，与DMC和DMR对应的基因是已知的男性生育力关键调控因子，并在男性减数分裂调控、种系保护、精子发生通路和早期胚胎发育中富集。
**讨论与结论**：研究人员的结果在三个独立队列中观察到，并得到荟萃分析的支持，表明精子线粒体基因组与核DNA甲基化之间存在一致性关联，提示mtDNAcn和甲基化模式可能在精子发生过程中相互关联。需要进一步研究阐明这些关联背后的机制，并评估其对生殖结局的相关性。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
男性因素约占全球不孕症病例的一半，传统精液分析虽能评估精子数量、活力、形态等参数，但对生殖结局的预测能力有限。因此，亟需更可靠、具有生物学信息的生物标志物来改善不明原因男性不育的诊断与理解。线粒体在精子能量代谢中起核心作用，虽然受精卵中的线粒体DNA（mtDNA）完全来自母系，但精子线粒体DNA拷贝数（mtDNAcn）已作为新型生物标志物与精子质量、胚胎发育及夫妇受孕时间相关联。精子发生过程中mtDNAcn约下降10倍，以确保父本mtDNA不被传递至卵子。mtDNA的复制与类核包装受核因子（如线粒体转录因子A，TFAM）严格调控，TFAM的精子特异性亚型因磷酸化而无法进入线粒体，转而定位至细胞核，与成熟精子中mtDNA的耗竭相关。近期研究显示，成熟精子中mtDNAcn不完全耗竭（即升高）与夫妇生育力降低、精液参数受损、受精潜能下降及辅助生殖中胚胎发育不良相关，这些关联在临床IVF人群和一般人群男性中均被观察到，提示mtDNAcn可能作为男性生殖潜能的非侵入性生物标志物。然而，mtDNAcn预测效用的生物学机制尚不清楚，一种可能的机制是精子mtDNAcn与核表观基因组之间的交互作用，即其中一方的变化可能影响另一方。鉴于精子表观基因组的可遗传性及其对生育力和子代健康的重要性，理解mtDNAcn与精子DNA甲基化的关系可能为男性生育力的分子机制提供新见解。
**研究内容与结论**
本研究旨在调查三个队列（一般人群队列LIFE和两个IVF临床队列SEEDS、EARTH）共748名男性精子样本中mtDNAcn与全基因组DNA甲基化谱的关联。通过进行表观基因组关联分析（EWAS）及随后的荟萃分析，研究人员鉴定出与mtDNAcn相关的一致且生物学相关的甲基化特征。主要结论：较高的mtDNAcn与精子中广泛的高甲基化相关，尤其是涉及精子发生、种系保护、减数分裂调控和早期胚胎发育的关键基因。这些关联在三个独立队列中具有高度可重复性，并在荟萃分析中得到进一步验证，表明mtDNAcn可能成为整体精子适应性和男性生育潜能的可靠分子生物标志物。该论文发表在《Andrology》期刊。
**主要技术方法**
本研究采用以下关键技术：1）样本队列：LIFE研究（379名一般人群男性，来自美国密歇根和德克萨斯州16个县），SEEDS研究（170名不孕症夫妇男性，来自马萨诸塞州斯普林菲尔德贝斯特医学中心IVF诊所），EARTH研究（199名不孕症夫妇男性，来自马萨诸塞州总医院生育中心）。2）精子mtDNAcn定量：使用三重探针数字PCR（dPCR），以RNAse P为核DNA参考，计算mtDNAcn。3）精子DNA甲基化分析：采用Illumina Infinium MethylationEPIC v1 BeadChip（覆盖超过85万个甲基化位点），数据经统一预处理流程（Noob背景校正、ComBat批次效应校正、探针过滤等）。4）统计方法：每个队列内进行协变量调整的线性回归（CpGassoc），调整年龄、吸烟状态、技术主成分PC1和DLK1甲基化百分比（控制体细胞污染）；使用BACON方法校正基因组膨胀，Holm–Bonferroni法校正多重比较；区域甲基化分析采用ipDMR pipeline；荟萃分析使用METAL工具进行逆方差加权固定效应模型。5）基因本体论（GO）分析：使用Metascape对DMC和DMR相关基因进行功能富集分析。
**研究结果**
**3.1 队列特异性CpG水平分析**
在LIFE、SEEDS和EARTH中，分别鉴定出28,800、15,217和8,136个FDR显著的DMC（q<0.05），其中高甲基化占绝大多数（98%、95%、96%）。经更严格的Holm–Bonferroni校正后，分别得到1,351、224和258个DMC，对应751、159和180个独特基因。三个队列间重叠的DMC有17个，对应21个基因（如QRICH2、DND1、CTCFL），这些基因富集于生殖细胞发育和细胞对刺激的应答通路。
**3.2 区域甲基化分析**
区域分析鉴定出LIFE、SEEDS和EARTH中分别有2,582、1,536和1,284个Holm–Bonferroni显著的DMR，对应1,791、1,163和974个基因。三个队列间共有907个DMR重叠，对应689个基因，富集于配子生成、男性不育、piRNA加工和减数分裂通路。
**3.3 荟萃分析**
对三个队列共同存在的756,017个CpG进行荟萃分析，鉴定出576个DMC（97%高甲基化），对应424个独特基因。这些基因富集的通路包括配子生成（如piRNA加工、减数分裂调控）、早期胚胎发育和1p36拷贝数变异综合征。关键基因如MAEL、DNHD1、SOHLH2、PRSS42、TDRD12和NKAPL均与精子发生和男性不育相关，且表现出与mtDNAcn一致的正向关联（效应量0.40–0.58）。
**3.4 敏感性分析**
加入精液质量指标作为额外协变量后，Holm–Bonferroni显著的CpG数量略有减少，但关键生物学通路（如精子发生、男性不育、配子生成）保持不变，说明结果稳健。
**讨论与结论**
本研究在三个独立队列中提供了可重复且生物学上有意义的证据：精子mtDNAcn与核DNA甲基化改变之间存在一致性关联。较高的mtDNAcn与精子发生、生殖细胞分化、piRNA介导的基因组防御、减数分裂细胞周期调控和染色质重塑相关基因的广泛高甲基化相关。重叠基因（如QRICH2、DND1、CTCFL）和DMR水平重叠的约700个基因（包括男性生育力经典调控因子）表明，这些关联并非队列特异性伪影，而是反映对线粒体DNA状态改变的核心表观遗传响应。荟萃分析进一步验证了关键基因（如MAEL、TDRD12、SOHLH2、DNHD1、PRSS42、NKAPL）的阳性关联，提示升高的mtDNAcn可能通过表观遗传抑制piRNA介导的沉默、减数分裂进展和减数后成熟，从而损害精子发育、结构和功能，即使在某些精液参数符合WHO阈值的男性中也如此。近期文献支持mtDNAcn与核DNA甲基化在精子和体细胞中的动态关系，例如在培养成纤维细胞中操纵mtDNAcn可导致核DNA甲基化剂量依赖性改变，影响细胞代谢相关基因表达。本研究局限性包括：横断面设计无法推断因果关系；参与者主要为白种人，需在更多样人群中验证；残留混杂和队列间变异可能存在。但主要优势在于整合了IVF和一般人群队列，允许在生育治疗和更广泛备孕背景下评估这一关系。
**结论**：在本研究中，升高的mtDNAcn与一般人群队列和两个临床队列中男性生殖功能关键基因的广泛高甲基化相关。精子mtDNAcn相关的甲基化变化发生在负责精子发生、piRNA保护男性种系和早期胚胎发育的基因中，提示精子mtDNAcn可能作为男性种系更广泛表观遗传不稳定性的潜在指标。这些发现在三个独立队列中的可重复性表明，mtDNAcn可能成为整体精子适应性和男性生育潜能的可靠分子生物标志物。
