《Journal of Water Process Engineering》：Development of a photoheterotrophic biofilm in a packed-bed reactor for the polishing of wastewater contaminated with parabens
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废水（wastewater, WW）处理过程因有必要在面对新一波污染物时改进废水处理厂（wastewater treatment plants, WWTPs）中的传统处理方法而受到广泛关注。新兴关注污染物（contaminants of emerging co
废水（wastewater, WW）处理过程因有必要在面对新一波污染物时改进废水处理厂（wastewater treatment plants, WWTPs）中的传统处理方法而受到广泛关注。新兴关注污染物（contaminants of emerging concern, CECs）因其对生态系统的长期影响仍不完全明确，已被列入需要高效去除的优先名单。在释放量较高的CECs中，对羟基苯甲酸酯由于广泛存在于多种日常产品中，因此在废水出水中被频繁检出。已有报道显示，其对生物体和人类的影响涉及生殖系统改变和免疫学改变，因此，从水体中高效去除此类CECs具有重要意义。常见的对羟基苯甲酸酯之一为甲基对羟基苯甲酸酯（methylparaben, MetP），通常在水体及废水出水中的检出浓度范围为65 ng/L至3142 ng/L。
利用微藻开展WW处理并非新的研究主题，但由于对更清洁、可持续WW处理策略的需求不断增长，相关研究兴趣持续上升。微藻因代谢可塑性而能够适应不同环境，并可将富营养化水体转化为可利用生物质。其中，普通小球藻（Chlorella vulgaris）因其稳健性、在不同工艺条件下较高的生长速率、混养生长能力以及去除新兴关注污染物的能力，而被认为是废水生物修复中的重要候选微生物。除微藻外，细菌在WW处理过程中同样具有重要作用，且某些菌株在此类系统中更为常见。红球菌属（Rhodococcus）具有较强环境适应性，可分布于清洁水体至高度污染表面等不同环境。该类细菌可依赖其代谢中的多条降解途径耐受并降解疏水性化合物和外源污染物（xenobiotics），包括农药、芳香烃、腈类、卤代及含氧化合物等。其独特的生化与生态学特征，如优异酶活性和高分解代谢多样性，使其成为WWTPs中生物修复相关过程的潜在优良菌属。
因此，将微藻与细菌构建为联合体（consortium），有望成为提升传统废水去除技术效果的方案，因为此类关联在自然界中普遍存在于生物膜和附着生物群落（periphyton）中。既往研究表明，细菌可通过生长促进激素提高微藻细胞生长速率，而微藻可释放代谢产物，如胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS），供细菌用于其生物过程。EPS释放还与微藻和细菌间的信息交流有关，从而促进水环境中的共生关系。尽管已有研究报道两类微生物在营养盐，尤其是氮（N）和磷（P），以及CECs去除中的协同效应，但多数研究采用的是由多种物种组成的复杂聚集体，难以明确各成员的具体作用。
本研究构建了一种填充床生物反应器（packed-bed bioreactor），以形成能够支持C. vulgaris与Rhodococcus fascians生长的光异养生物膜（photoheterotrophic biofilm），并分别在悬浮态与载体附着态中考察两者的相互作用，包括细胞生长、EPS产生，以及在N、P和MetP去除中的协作效应。同时设置无菌单培养（axenic cultures），以识别各微生物的作用及共培养过程中发生的协同相互作用。本研究旨在进一步拓展既往围绕这两种微生物所建立的研究基础，并缩小实验室尺度试验与WWTPs真实生物修复技术之间的距离。由于各菌株的具体作用及微藻—细菌间特异相互作用难以评估，且文献中鲜有报道，本研究在废水生物修复领域具有独特性。
该文发表于《Journal of Water Process Engineering》。研究聚焦于废水深度处理阶段中新兴污染物与营养盐协同去除这一关键问题。随着废水处理厂对传统污染物的控制逐渐成熟，含有药物、个人护理品及防腐剂等新兴关注污染物的二级出水，已成为水环境风险管理中的难点。对羟基苯甲酸酯类化合物因广泛应用于日化与医药产品，在废水出水中普遍存在，其中甲基对羟基苯甲酸酯（methylparaben, MetP）检出频率较高。现有处理体系虽然能够部分削减常规污染负荷，但对这类微量有机污染物的去除效率有限，同时还需兼顾氮（N）和磷（P）等营养盐的进一步削减。因此，开发可持续、低能耗且兼具营养盐与新兴污染物去除能力的生物处理策略，具有明显现实需求。
在这一背景下，研究人员选择普通小球藻（Chlorella vulgaris）与Rhodococcus fascians构建可控的双成员菌藻联合体系。C. vulgaris具备较强环境适应性、较高生长速率、混养潜力以及一定污染物去除能力；Rhodococcus属则以代谢多样性强、可降解多类疏水性和芳香族污染物而受到关注。自然界中，微藻与细菌常以生物膜形式稳定共存，但有关特定菌株间作用分工、附着生长优势及其对污染物去除贡献的研究仍较少。因此，该研究的核心目的，是在填充床反应器中构建光异养生物膜，系统比较单培养与共培养、悬浮态与附着态之间的差异，并明确该双成员联合体在营养盐和MetP去除中的功能表现。
研究人员首先搭建并优化了改良型填充床反应器，以K5载体作为生物膜附着界面，在模拟二级出水的合成废水中培养C. vulgaris、R. fascians及其联合体。结果表明，K5载体能够成功支持光异养生物膜形成，而R. fascians显著增强了C. vulgaris在载体表面的附着。与单独培养微藻相比，共培养条件下生物膜中微藻附着密度更高，同时联合体在悬浮相和生物膜中的EPS产量也更高，说明二者之间存在促进生物膜构建的协同作用。进一步考察MetP存在时的细胞行为发现，MetP促进了R. fascians生长，但对联合体中微藻生长无显著抑制；相反，单独培养的微藻在MetP暴露下生长受影响，提示细菌对微藻具有一定保护或缓冲作用。
在废水处理功能方面，联合体在无MetP条件下对N和P的去除显著优于单独微藻，而单独细菌对营养盐去除作用有限；在加入MetP后，营养盐去除能力整体下降，但联合体仍优于单培养体系。更关键的是，在MetP去除方面，联合体和单独R. fascians均可逐步去除该污染物，而单独C. vulgaris仅表现出有限去除能力，且文中结合无生物对照说明，光照对MetP去除具有一定贡献，但不能解释联合体系的完整去除效果。综合而言，R. fascians是MetP去除中的关键功能成员，而C. vulgaris主要承担营养盐削减功能；二者形成联合后，可实现单菌体系难以兼顾的多目标废水抛光处理。
从方法学上看，研究的重要意义在于以明确定义的双成员联合体替代复杂天然混合群落，从而提高了对微藻—细菌相互作用机制的解析度。与此同时，采用填充床反应器和工业常用K5载体，使实验设计更接近工程化应用场景，增强了成果向污水处理厂深度处理单元转化的潜力。研究表明，菌藻联合生物膜不仅可改善附着、生长和EPS分泌，还能实现营养盐与新兴污染物的协同去除，这为发展低碳、可持续的废水抛光技术提供了新的思路。
在关键技术方法方面，研究主要采用以下策略：其一，构建改良型填充床反应器，以K5高密度聚乙烯载体培养附着生物膜，并在合成二级出水中进行连续光照循环培养；其二，设置C. vulgaris单培养、R. fascians单培养及二者共培养体系，对比悬浮态与附着态细胞生长；其三，利用流式细胞术（flow cytometry）区分并定量微藻与细菌；其四，采用酚-硫酸法和Bradford微量法测定EPS中的多糖与蛋白；其五，通过高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）定量MetP，并结合营养盐分光检测评价废水生物修复性能。样本来源为研究人员配置的模拟二级出水合成废水体系，而非临床或人群队列样本。
在研究结果部分，论文围绕两个大节展开分析。
3.1. Microbial interactions in the consortium
该部分聚焦菌藻联合体内部相互作用，重点分析细胞生长、MetP影响及EPS分泌，旨在解释光异养生物膜形成与功能增强的基础。
3.1.1. Cellular growth: biofilm vs suspended growth
研究人员通过比较K5载体表面与悬浮液中的细胞数量，证实R. fascians有助于提高C. vulgaris的附着生长。在生物膜中，共培养条件下C. vulgaris单位面积附着量显著高于单培养，说明细菌作为早期定殖者有利于微藻黏附和定植；而R. fascians在共培养生物膜中的附着量低于其单培养，提示载体表面积与种间竞争可能限制了细菌进一步累积。相反，在悬浮培养中，单培养的微藻和细菌生长均高于共培养，表明同一对微生物在附着态和悬浮态中的互作方式存在明显差异。该结果支持了自然环境中菌藻关系更适合通过生物膜结构表现其协同优势的观点。
3.1.2. Influence of MetP on cellular growth
研究人员在形成生物膜后向体系加入MetP，考察污染物对细胞生长的影响。结果显示，MetP并未抑制联合体中C. vulgaris与R. fascians的生长，且R. fascians在有MetP时生长更好，提示其可能参与MetP代谢或利用其降解相关产物。相比之下，单培养C. vulgaris在MetP暴露后生长明显下降，说明细菌共存可减轻MetP对微藻的不利影响。该部分结果揭示，菌藻联合可提升体系对污染胁迫的耐受性，尤其体现在微藻保护和细菌功能增强两个层面。
3.1.3. EPS production on the bioreactor
研究人员测定了生物膜与悬浮相中的EPS含量，发现共培养体系在多糖和胞外蛋白两个维度上均高于单培养。载体表面双种生物膜的EPS含量显著高于单独微藻生物膜，且在MetP存在时，除单培养细菌蛋白外，大多数体系的EPS均进一步增加。该结果表明，菌藻共存可强化EPS分泌，而污染胁迫又可进一步刺激其释放。由于EPS与细胞黏附、群体保护、信息交流及碳源循环有关，这一发现为解释联合体更稳定的附着生长及更优的处理性能提供了机制支撑。文中同时指出，尽管可确定共培养存在EPS协同增产现象，但无法仅据现有数据判定微藻或细菌何者为主要EPS来源。
3.2. Wastewater bioremediation performance
该部分从应用功能出发，评估已构建体系对营养盐与MetP的去除表现，是全文工程意义最直接的部分。
3.2.1. Nutrient removal
研究人员在无MetP条件下监测N和P浓度变化，发现含C. vulgaris的体系均能持续消耗营养盐，而菌藻联合体的去除效率显著高于单独微藻。联合体的N去除率达到87.6%至96.4%，P去除率达到49.4%至73.7%；单独微藻对应范围则较低。单独R. fascians对N去除作用较弱，对P几乎无去除甚至出现累积。结果说明，微藻是营养盐去除的核心成员，而细菌通过共培养可显著增强这一过程。加入MetP后，联合体和单独微藻在最初4天仍能维持约50%的N去除，但随后去除能力明显下降，P甚至出现累积，提示MetP干扰了原有营养盐代谢平衡。尽管如此，联合体在整体表现上仍优于单培养体系。
3.2.2. Effectiveness of the heterotrophic biofilm on MetP removal
针对MetP去除效果，研究人员比较了联合体、单独微藻、单独细菌及无生物对照。结果表明，联合体和单独R. fascians均可在9天内逐步去除MetP，而单独C. vulgaris仅能部分去除。结合光照对照结果，研究人员认为微藻对MetP去除贡献有限，R. fascians则很可能是联合体中MetP去除的关键执行者。文中进一步指出，生物膜附着方式可能提升了细菌单位面积细胞密度并改变代谢状态，从而提高污染物去除能力。与此同时，尽管联合体和微藻体系EPS较高，但EPS含量与MetP去除效率并未呈正相关，因此不能将MetP高去除率简单归因于EPS增加。
在讨论层面，论文强调了三点。首先，微藻—细菌联合体的功能优势具有环境依赖性：在附着态中，细菌促进微藻定殖并增强生物膜形成；在悬浮态中，则可能出现竞争或拮抗效应。其次，MetP对体系既是胁迫因子，也是潜在代谢底物，特别对R. fascians而言，污染物存在可能促进其生长并改变联合体内营养代谢平衡。再次，工程上若希望同时实现营养盐和新兴污染物去除，单独依赖微藻或细菌均存在明显短板，而构建功能互补的双成员生物膜体系更具应用前景。
研究结论部分可译为：研究人员评估了C. vulgaris与R. fascians在联合培养中的生长表现，以进一步探索更清洁、可持续的受CECs污染废水生物修复方式。在MetP存在条件下，无论在悬浮态还是附着态环境中，与细菌共培养均对微藻细胞生长产生积极影响。EPS产生亦呈现相同趋势，联合体在悬浮体系和K5载体生物膜发育过程中均获得最高水平。尽管MetP的存在干扰了营养盐去除，但与单培养C. vulgaris相比，菌藻联合体实现了该新兴污染物的完全去除。值得指出的是，虽然单培养R. fascians同样能够去除MetP，但由于其无法有效实现N和P去除，因此整体生物修复效果并不完整；而联合体在引入该新兴污染物之前及之后均能实现营养盐去除，尽管污染物加入后去除速率有所下降。
