工程化益生菌平台用于 resolvin E1 生物合成赋予炎症性疾病保护作用

《Clinical and Translational Medicine》：Engineered probiotics platform for resolvin E1 biosynthesis confers protection against inflammatory disease

　　

背景：炎症的消退是由 ω-3 多不饱和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) 通过其专门促消退介质 (specialized pro-resolving mediators, SPMs) 衍生物主动驱动的，其中包括 resolvin E1 (RvE1)，其作用已得到充分证实。然而，这些介质的临床应用受到固有不稳定性和高昂生产成本的阻碍。方法：为克服这些障碍，研究人员基于益生菌大肠杆菌 Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917, EcN) 设计了一个生物合成平台，通过诱导表达环氧合酶 2 (cyclooxygenase 2, COX2) 和 5-脂氧合酶 (5-lipoxygenase, 5-LOX) 实现可控、持续的 RvE1 生产，命名为 EcN-RvE1。研究人员在体外以及 LPS 诱导的急性炎症和 DSS 诱导的结肠炎小鼠模型中评估了该平台的催化能力、肠道持久性和治疗效果。结果：在这项研究中，研究人员验证了 EcN-RvE1 催化二十碳五烯酸 (eicosapentaenoic acid, EPA) 转化为 RvE1 的能力，并确认了其实现长期肠道持久性的能力。在急性炎症和结肠炎小鼠模型中，EcN-RvE1 发挥显著的抗炎和组织保护作用，其机制是通过调节炎性细胞因子表达和改善肠道菌群失调介导的。此外，使用裸藻 (Euglena gracilis) 作为基于光合原生动物的 PUFAs 来源的 EcN-RvE1 也表现出保护性抗炎活性。结论：总体而言，研究人员报告了一个用于 RvE1 生物合成的益生菌工程平台，为在临床环境中利用 PUFAs 衍生物的抗炎潜力提供了一种新策略。

该研究发表于《Clinical and Translational Medicine》。目前炎症管理面临重大临床挑战，传统糖皮质激素和生物制剂虽能抑制炎症，但伴有显著副作用且无法逆转已建立的组织损伤。炎症的主动消退由专门促消退介质 (specialized pro-resolving mediators, SPMs) 驱动，其中源自 ω-3 多不饱和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) 二十碳五烯酸 (eicosapentaenoic acid, EPA) 的 resolvin E1 (RvE1) 具有强效促消退作用，但其化学不稳定、半衰期短及全化学合成成本高昂限制了临床转化。为此，研究人员利用合成生物学构建基于益生菌大肠杆菌 Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917, EcN) 的工程化平台 EcN-RvE1，实现肠道内原位持续合成 RvE1，旨在克服递送瓶颈并提供非侵入性低成本治疗策略。

研究人员主要采用的关键技术方法包括：构建阿拉伯糖 (arabinose, Ara) 诱导的 pBAD 表达系统携带人源 COX2 与 5-LOX 串联序列的重组 EcN 菌株；利用 8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠建立 LPS 诱导的急性全身炎症模型与 4% 葡聚糖硫酸钠 (dextran sulphate sodium, DSS) 诱导的结肠炎模型；通过口服灌胃 (intragastric, i.g.) 给药评估疗效；采用 ELISA 与 LC-MS/MS 检测 RvE1 及氧化脂质 (oxylipin) 代谢谱；运用 16S rDNA 扩增子测序分析粪便菌群组成；结合组织学评分、免疫组化及生化指标测定多器官炎症与屏障功能。

3 RESULTS

3.1 Construction and in vitro functional validation of the RvE1 biosynthetic engineered probiotic

研究人员将人 COX2 (PTGS2) 与 5-LOX (ALOX5) 基因密码子优化后通过 P2A 自剪切肽连接构建于 pBAD 载体转入 EcN，获得 EcN-RvE1。生长曲线显示重组菌株与野生型生长无差异，Western blot 证实 37°C 下 0.4% 阿拉伯糖诱导表达效率更高。ELISA 检测显示 EcN-RvE1 在乙酰化 COX2 剂阿司匹林 (acetylsalicylic acid, ASA) 及底物 EPA 存在下能将 EPA 转化为 RvE1，且串联表达优于混合菌株。LC-MS/MS 氧化脂质分析虽因稳定性未直接检出 RvE1，但 PCA 分析显示 EPA 处理组与对照组代谢谱分离，KEGG 富集表明不饱和脂肪酸生物合成等通路正向富集，证实工程菌重塑了脂质氧化网络。

3.2 Validation of in vivo colonization capacity of EcN-RvE1

研究人员对 C57BL/6 小鼠灌胃 10⁹ CFU EcN-RvE1 每周三次，于末次灌胃后第 7、30、60 天收集粪便培养。结果显示第 7 天菌落数达 7 × 10⁷ CFU/mL，第 60 天仍达 4 × 10⁵ CFU/mL，证明 EcN-RvE1 具备长期肠道持久性。第 60 天菌落 PCR 测序证实含有 COX2 和 5-LOX 基因，排除抗性基因水平转移可能，确认为工程菌本身定植。

3.3 Therapeutic efficacy of EcN-RvE1 in LPS-induced acute inflammation mice

在 LPS 诱导的急性炎症模型中，EcN-RvE1 干预组脾脏形态恢复，脾脏指数（脾重/体重）显著低于模型组。H&E 染色显示 EcN-RvE1 减轻了肝脏索紊乱、坏死，肺肺泡充血及小肠黏膜结构破坏，降低血清 AST 和 ALT 水平。RT-qPCR 显示 EcN-RvE1 显著降低肝、肺、小肠中 Tnf、Il1b、Il6 等促炎细胞因子转录水平，并逆转抗炎因子 Il10 的下降。表明 EcN-RvE1 在全身急性炎症峰值通过抑制炎症和多器官保护发挥早期促消退效应。

3.4 Therapeutic efficacy of EcN-RvE1 in DSS-induced colitis mice

在 DSS 诱导的结肠炎模型中，结肠组织匀浆 ELISA 证实体内 RvE1 水平升高。EcN-RvE1 显著减轻体重丢失和疾病活动指数 (disease activity index, DAI) 升高，降低髓过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO) 活性（中性粒细胞浸润标志）。EcN-RvE1 缓解了结肠缩短，H&E 评分显示组织损伤和炎症细胞浸润减少，AB-PAS 染色显示杯状细胞和黏液层损伤改善，免疫组化恢复紧密连接蛋白 ZO-1 和 occludin 表达。使用裸藻 (Euglena gracilis) 粉末替代纯 EPA 作为底物组同样显示出与上述一致的抗炎和保护效果，证实可持续底物来源的可行性。

3.5 EcN-RvE1 correlates with the amelioration of gut microbiota dysbiosis in DSS-induced colitis mice

16S rDNA 测序显示 EcN-RvE1（无论 EPA 或裸藻底物）改善了 DSS 导致的 α 多样性（Shannon、Chao1 指数）下降。PCoA 与 NMDS 分析表明 DSS 引起显著微生物群落失调，而 EcN-RvE1 干预使菌群结构向对照组偏移。在门水平，EcN-RvE1 恢复了 Firmicutes 丰度并抑制 Proteobacteria 过度增长；在科和属水平，抑制致病菌 Enterobacteriaceae 扩张，富集有益菌 Lachnospiraceae、Akkermansia 和 Alistipes。Simper 分析确认 Lachnospiraceae 和 Akkermansia 是驱动分组差异的关键贡献者，表明 EcN-RvE1 通过恢复核心产丁酸菌和屏障保护菌改善菌群失调。

4 DISCUSSION

讨论部分指出，传统抗炎药局限性与 SPMs 治疗范式转变背景下，EcN-RvE1 利用非致病 EcN 作为底盘实现原位持续合成 RvE1，规避了外源性 RvE1 的不稳定性与递送难题。其疗效源于双重机制：直接通过 RvE1-ChemR23 抑制 NF-κB 通路下调促炎因子，以及间接通过重塑菌群-免疫轴富集有益菌如 Lachnospiraceae（产短链脂肪酸）和 Akkermansia 增强屏障功能。裸藻与 EcN-RvE1 联用构成合生元 (synbiotic) 系统，其 β-葡聚糖具免疫调节性，具转化意义。局限性包括样本量较小、未设无阿拉伯糖对照（但 EcN 对照无保护证实特异性）、LPS 模型未评估后期消退动力学、需构建失活突变体验证特异性、目前依赖阿司匹林乙酰化 COX2 及氨苄青霉素抗性基因需未来替换为食品级系统或染色体整合、需考察性别与年龄影响及长期安全性。未来需优化酶系统、工程化产 EPA 益生菌及药代动力学研究。

结论翻译

总之，研究人员报告了一个基于益生菌 EcN 的 RvE1 生物合成工程益生菌平台 EcN-RvE1。研究人员证实其通过调节炎性细胞因子和改善肠道菌群失调的双重机制减轻了急性炎症和结肠炎，并且其能与光合原生动物来源的 PUFAs 源裸藻协同作用形成潜在的合生元配方。该平台作为一种促进炎症消退和组织保护的口服治疗药物具有前景，为克服基于 SPMs 的治疗药物的应用瓶颈提供了可行策略，并为炎症性疾病的精准干预开辟了新方向。