《Materials & Design》：Anti-fibronectin aptamer-functionalized zirconia promotes human gingival fibroblast adhesion and proliferation for enhanced peri-implant soft tissue sealing
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抗纤连蛋白适配体（Anti-fibronectin aptamers）通过共价键合方式固定于生物惰性氧化锆（zirconia）表面。表面处理显著改善了亲水性并促进了纤连蛋白（fibronectin, FN）的吸附。修饰后的表面增强了牙龈成纤维细胞的粘附和增殖。
抗纤连蛋白适配体（Anti-fibronectin aptamers）通过共价键合方式固定于生物惰性氧化锆（zirconia）表面。表面处理显著改善了亲水性并促进了纤连蛋白（fibronectin, FN）的吸附。修饰后的表面增强了牙龈成纤维细胞的粘附和增殖。整合素β1（integrin β1）和粘着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）的上调介导了细胞反应的改善。稳定的生物界面促进了强有力的种植体周围软组织封闭。
**论文解读：抗纤连蛋白适配体功能化氧化锆促进人牙龈成纤维细胞粘附和增殖**
**研究背景与问题**
种植牙的长期稳定性依赖于骨整合和种植体周围软组织附着。软组织附着作为抵御细菌入侵的屏障，对维持种植体周围健康至关重要。然而，与天然牙相比，种植体周围的软组织结构更为脆弱，其胶原纤维呈平行排列，血管网络减少，呈现出类似瘢痕组织的表型，再生能力有限，对炎症和机械应力的抵抗性较差。从分子层面看，软组织附着的建立始于材料表面从体液中吸附蛋白质，形成条件层，该层蛋白决定了后续的细胞行为。纤连蛋白（FN）作为一种关键的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）糖蛋白，在促进细胞粘附和整合中扮演核心角色，但生理条件下蛋白吸附是随机的，非粘附蛋白或构象改变的FN可能占据界面，导致细胞-材料相互作用不佳。目前，通过物理吸附或共价偶联直接固定FN或其衍生物的策略，常因蛋白水解和构象不稳定而影响生物活性。因此，本研究提出一种替代策略，即利用抗纤连蛋白适配体（anti-fibronectin aptamer）功能化氧化锆（zirconia）基台表面，使其主动从生理环境中招募FN，从而构建一个支持软组织整合的生物活性界面。
**主要研究内容与结论**
研究人员开发了一种新型表面修饰方法，通过两步化学处理（NaOH蚀刻和pVBA处理）在氧化锆表面引入羧基，进而利用EDC/NHS化学共价偶联抗纤连蛋白适配体。研究系统表征了修饰后的表面，并评估了其对人口腔牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts, HGFs）粘附、铺展、增殖、基因/蛋白表达的影响，以及早期细菌粘附情况。研究发现，该适配体与FN具有高亲和力（K
D ≈ 173.6 nM）。修饰后的表面成功固定了适配体，改善了亲水性，并有效招募了FN。体外细胞实验表明，适配体功能化表面显著促进了HGFs的粘附、铺展和增殖，上调了整合素β1（integrin β1）、粘着斑激酶（FAK）、FN和I型胶原（Col-I）的基因和蛋白表达。免疫荧光验证显示，优化后的表面增强了粘着斑相关蛋白（vinculin）和膜相关整合素β1的分布，并促进了Col-I的沉积。重要的是，该修饰并未增加早期代表性的口腔早期定植菌——戈登链球菌（*Streptococcus gordonii*）的粘附。这些结果表明，抗纤连蛋白适配体功能化氧化锆可构建一个有利的生物界面，支持HGF介导的软组织相关反应，同时保持与未处理氧化锆相当的细菌粘附水平。该研究为改善氧化锆基台的软组织相容性提供了一种有前景的策略，论文发表在《Materials》。
**主要关键技术方法**
1. **表面化学修饰与适配体固定化**：研究人员采用两步化学法（NaOH溶液处理结合pVBA溶液处理）在氧化锆表面引入羧基，再通过EDC/NHS化学法将5‘端氨基修饰的抗纤连蛋白适配体共价偶联到氧化锆表面。
2. **生物物理表征技术**：利用生物层干涉测量法（BLI）评估适配体与FN的结合亲和力；使用X射线光电子能谱（XPS）确认表面元素组成；通过扫描电子显微镜（SEM）和3D光学轮廓仪观察表面形貌和粗糙度；采用水接触角测量仪评估表面润湿性。
3. **体外细胞生物学与分子生物学分析**：使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估HGFs的粘附、铺展（F-actin、vinculin染色）及FN招募（免疫荧光）；采用CCK-8试剂盒评估细胞增殖；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）分析整合素β1、FAK、FN、Col-I的基因和蛋白表达水平。
4. **细菌粘附评估**：通过扫描电子显微镜（SEM）观察和XTT代谢活性检测，评估早期定植菌戈登链球菌（*S. gordonii*）在修饰表面的粘附情况。
**研究结果**
**3.1. 抗纤连蛋白适配体与FN的高亲和力结合**
BLI测量显示，固定的适配体与FN之间存在强相互作用，解离常数（K
D）为173.6 nM，表明该适配体具有适用于从生理液体中捕获FN的高亲和力。
**3.2. 修饰后氧化锆表面的理化表征**
SEM图像显示所有组表面均平坦，无显著形貌差异。轮廓仪确认各组间表面粗糙度无显著差异（约0.10 μm）。XPS谱图显示，适配体修饰组表面出现特征性磷（P）峰，证明适配体成功固定。水接触角测量显示，修饰过程逐步改善了表面亲水性，从未处理氧化锆的约78°降至适配体修饰后的约37°。
**3.3. 抗纤连蛋白适配体在氧化锆表面上的偶联、稳定性及功能保留**
CLSM证实适配体以剂量依赖性方式成功共轭在氧化锆表面。免疫荧光分析表明，适配体修饰表面相比未处理对照组，FN覆盖面积显著更大。稳定性测试显示，在28天内适配体释放率约为53%，且在人工唾液老化14天后，修饰表面仍保留了高于对照组的FN招募能力。
**3.4. 人牙龈成纤维细胞（HGF）反应**
**3.4.1. 抗纤连蛋白适配体修饰改善HGF粘附和铺展**
培养3小时和24小时后，适配体修饰组，特别是4 μg组，均显示出显著更高的细胞粘附数量和更大的细胞铺展面积，细胞形态更佳，并观察到细胞间桥接连接。
**3.4.2. 抗纤连蛋白适配体修饰改善HGF增殖**
CCK-8检测显示，从第3天起，适配体修饰组成剂量和时间依赖性促进HGF增殖，其中4 μg组效果最显著。
**3.4.3. 抗纤连蛋白适配体修饰上调HGF粘附相关基因和蛋白**
RT-qPCR和Western blot结果表明，在4 μg适配体修饰组，HGFs的整合素β1、FAK、FN和Col-I的mRNA和蛋白表达水平均显著上调。
**3.5. HGF粘附相关反应和胶原沉积的免疫荧光验证**
在4 μg适配体修饰组，HGFs显示出更明显的vinculin阳性信号，且呈更有序的粘着斑样分布；膜相关整合素β1信号更强、更广泛；培养7天后，Col-I沉积更强、更连续，呈纤维/网络状分布。
**3.6. 适配体功能化氧化锆表面上的细菌粘附**
SEM观察和XTT检测均显示，适配体修饰组与对照组相比，早期戈登链球菌（*S. gordonii*）的粘附数量和代谢活性均无显著差异。
**总结与讨论**
本研究成功开发了一种抗纤连蛋白适配体功能化氧化锆表面，该表面通过共价固定适配体，实现了对FN的选择性招募，从而显著改善了HGFs的粘附、铺展、增殖及ECM相关基因和蛋白表达，同时未增加早期代表性口腔细菌的粘附。该策略通过提供分子识别位点，而非预涂外源蛋白，为改善种植体-软组织界面提供了一个有前景的生物功能化平台。然而，研究也指出，后续研究需要进一步量化并优化适配体表面密度，评估招募FN的构象状态，并在更接近临床条件的酶解、机械和多物种微生物环境中，以及通过体内动物模型来验证其功效和稳定性。
