用于脊髓损伤修复的可3D打印水凝胶中的双重机械与生化仿生

《Materials & Design》：Dual mechanical and biochemical mimicry in 3D-printable hydrogels for spinal cord injury repair

　　

研究人员开发了一种双重仿生且可三维(3D)打印的支架，旨在同时复制天然脊髓的机械性能与生化组成。该支架通过减少炎症与胶质瘢痕形成，同时促进内源性神经干细胞(NSC)招募及神经元分化，重建了再生微环境。多组学分析揭示轴突导向、突触组装及神经传递通路的激活，从而在脊髓损伤(SCI)后改善功能恢复。

研究背景方面，脊髓损伤(SCI)因中枢神经系统有限再生能力导致不可逆感觉运动功能障碍，原发性机械损伤引发缺血、炎症及胶质活化等继发性级联反应，形成物理屏障（反应性星形胶质细胞与成纤维细胞构成的致密胶质瘢痕及组织退变囊腔）与生化屏障（髓鞘相关抑制分子如MAG、Nogo-A、Semaphorin 3A及髓鞘碎片），阻碍轴突再生与神经元修复。现有组织工程策略（神经营养因子递送、抑制分子中和、干细胞疗法）功能恢复有限，需整合策略应对复杂损伤微环境。天然脊髓细胞外基质(ECM)虽提供结构与生化线索，但脱细胞ECM(dECM)水凝胶力学强度不足与降解过快限制其临床转化，同时实现力学稳健性与生化保真度仍是脊髓修复重大挑战。为此，研究人员开展双重仿生可3D打印水凝胶支架(HDA)研究，整合dECM生化仿生与Ca²⁺配位键可逆交联及稳定共价交联的双交联网络力学仿生，重构原生脊髓微环境特征，假设植入该支架可通过调节炎症与胶质瘢痕减轻继发性损伤、促进内源性NSC招募与神经元分化并最终增强功能恢复，经多组学验证同步靶向生化与力学屏障对神经再生至关重要。该研究发表于《Materials》。

主要关键技术方法包括：制备猪源脱细胞脊髓基质(DSCM)并进行结构表征与蛋白质组学分析；构建HAMA/Alg-Ca²⁺动态双交联网络水凝胶墨水并优化海藻酸盐(Alg)含量（HDA-6至HDA-12配方），通过流变学表征屈服应力、粘弹性及挤出行为评估打印适性；采用T9–T10脊髓挫伤大鼠模型（损伤腔约2±0.5 mm）进行体内移植，设置未处理SCI组与H-A（无DSCM的双交联水凝胶）对照组；结合活死染色、CCK-8、巨噬细胞极化（CD86、CD206）免疫荧光及溶血率评估细胞相容性与免疫调节；通过BBB评分、膀胱尿潴留体积评估运动与膀胱功能，组织学（H&E、Masson、免疫荧光Nestin、Tuj-1、NF、GFAP）分析再生与瘢痕；转录组学分析差异基因与GO、KEGG富集。

研究结果部分，3.1 Bioink design and multi-omics profiling of DSCM：制备猪源DSCM，H&E与Masson三色染色确认细胞成分完全去除且保留ECM架构，Alcian blue染色验证糖胺聚糖保留，DNA定量残量低于50 ng mg^?1符合生物安全要求，胶原定量证实结构蛋白保存；蛋白质组学显示DSCM主要由胶原（14.5%）、糖蛋白（29.6%）、蛋白聚糖（18.5%）及ECM关联调节蛋白组成，GO分析富集细胞迁移、轴突细胞骨架组织、线粒体转运与髓鞘化通路，组分分析鉴定丰富黏附分子（层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、COL1A1、COL6A5），表明DSCM兼具结构支架与促神经修复生物活性调节基质功能。

3.2 Rheological characterization：纳入动态HAMA/Alg-Ca²⁺交联网络克服dECM力学弱点，优化HAMA取代度28.6%确保405 nm下光交联效率与粘弹性平衡，终水凝胶模量～5 kPa匹配原生脊髓组织（大鼠、猪、人5–12 kPa）。四种配方（HDA-6、HDA-8、HDA-10、HDA-12）流变学显示HDA-10屈服点160%平衡刚度与加工性，损耗因子(tan δ)由0.70降至0.43呈液固转变，HDA-8与HDA-10具最优粘弹性平衡；均具剪切稀化行为（流动指数0²⁺配位至5.34±0.66 kPa）形成稳定双网络，循环应变测试证实快速力学恢复与结构回弹性，模量位于生理范围支持神经干细胞分化与组织整合。

3.3 Filament fidelity and shape fidelity analysis：22G针头挤出测试HDA-6、HDA-8、HDA-10连续均匀丝条，HDA-12堵塞不连续；丝条坍塌测试HDA-10弯曲角最小形状保持最优，HDA-6与HDA-8显著下垂；丝径与出口膨胀分析HDA-10直径最稳膨胀最小。22G针头打印30×30 mm单层网格构型指数(Pr)最接近1，20G孔隙圆化(Pr<1)，25G不规则变形(Pr>1)。SEM显示DSCM整合使孔径由38 μm(H-A)降至34 μm，孔隙率由66.8%升至72.5%，网络连通性增强；22G针头多层打印10 mm高构造几何稳定，垂直堆叠与结构完整。

3.4 Pre-investigation on cytocompatibility and in vitro immunomodulation：HDA-10培养细胞5天存活率>90%，增殖显著高于HAMA(HA)与空白对照；LPS刺激巨噬细胞HDA显著降低CD86、升高CD206荧光与流式CD206阳性巨噬细胞达65.9%（对照34.7%、H-A 37.4%），诱导抗炎表型转换，H-A无此效应；溶血率<5%符合ISO 10993–4血液接触生物材料标准，具良好血液相容性。

3.5 The recovery of motor and bladder function following spinal cord injury in vivo：大鼠T9–T10挫伤模型植入HDA，8周大体形态HDA组组织架构更连续有序，生存分析HDA组生存率显著升高；MRI T2加权早期HDA组见部分纤维重连迹象。体外降解14天保留～40%质量，体内4周HDA维持结构完整，8周大部降解被再生组织替代，SCI组持续囊腔与致密瘢痕。BBB评分第4周起HDA显著升高，第8周达8±1.4（H-A 2±0.5，SCI 2±0.3）；膀胱尿潴留第3周起HDA显著减少；膀胱组织学HDA组壁厚显著增加、重量显著减少，形态接近假手术组；脊髓组织学HDA显著减小空洞、保留组织连续性，8周胶原沉积显著减少纤维化。

3.6 Dual-biomimetic hydrogel scaffolds enhance endogenous NSC recruitment, migration, and differentiation into functional neurons for spinal cord injury repair：免疫荧光SCI与H-A组Nestin阳性内源性神经干细胞(NSC)局限于损伤边界，HDA显著增加Nestin密度并促进向损伤核心迁移，第8周Nestin强度显著更高；Tuj-1染色SCI与H-A稀疏边缘分布，HDA第4至8周Tuj-1阳性神经元显著增加并伸入核心，强度由53.9±8.4%升至69.9±11.1%，对照无显著变化；荧光空腔分析HDA残留损伤体积显著减小。

3.7 Dual-biomimetic hydrogel enhances neural regeneration and modulates glial response in spinal cord injury repair：NF染色第4周NF阳性纤维从边缘向核心延伸，第8周穿透病灶部分桥接空腔，高倍见排列连续轴突结构，HDA组NF强度显著更高；GFAP染色SCI与H-A组病变中心致密GFAP累积，HDA显著降GFAP强度与阳性面积呈弥散分布，抑制胶质瘢痕。H-A仅部分结构支持但无法有效抑制星形胶质活化。

3.8 Transcriptomic analysis further elucidates the molecular mechanisms by which HDA hydrogel remodels the injured spinal cord microenvironment：转录组PCA显示HDA、H-A、对照转录谱分离；差异表达分析HDA vs H-A上调2408、下调2198，HDA vs 对照上调2398、下调2302。上调基因关联神经元黏附(Cdh2、Dscam1)、迁移(Dcx、Celsr2)、分化(NeuroD、Wnt3)、突触组织(Lrrc4、Neur1)，GO富集突触信号、突触组织、神经递质转运；下调基因关联炎症(Trem2、C1qa)、纤维化(Cdkn1a、Ccna2)、星形胶质活化(Gfap、Vim)，GO富集白细胞活化与炎症反应抑制；KEGG富集GABA能、谷氨酸能、胆碱能突触及逆行内源性大麻素信号等神经传递通路，跨组比较一致显示神经信号增强与免疫伤口愈合通路降低。

讨论部分总结：研究人员指出SCI因中枢再生受限致不可逆神经功能障碍，主要挑战在于同时应对损伤微环境生化与力学屏障。本研究开发由脱细胞脊髓细胞外基质(dECM)与动态HAMA/Alg-Ca²⁺网络构成的双重仿生可3D打印水凝胶支架(HDA)，更好重现原生脊髓特性以改善再生。该系统整合dECM生化线索与双交联网络可调粘弹性及结构稳定性，具剪切稀化可注射性与足够力学完整性维持损伤空间，相较单一模式仿生整合生化与力学于单一构造，且3D打印适配不规则缺损。体内结果表明HDA改善内源性神经干细胞(NSC)招募、增强神经元分化、减少胶质瘢痕、促进轴突再生，伴随运动与膀胱功能改善。转录组证实HDA上调神经发生、轴突导向、突触组织基因，下调炎症与纤维化反应基因，协调转向促再生转录状态。局限包括功能恢复主要依赖行为与组织学，需直接电生理连接与长期环路整合评价，再生组织长期稳定性与支架降解效应需进一步研究；临床转化中放大生产与灭菌（如γ辐照对结构与生物活性影响）需标准化评估。总体而言HDA结合生化与力学仿生构建许可神经修复微环境，双重仿生策略具SCI修复潜力，但各组分相对贡献与体内长期相互作用需进一步研究优化临床转化。

研究结论部分翻译：脊髓损伤(SCI)因中枢神经系统有限再生能力导致不可逆神经功能障碍。SCI修复主要挑战在于同时应对损伤微环境内的生化与力学屏障。本研究中，研究人员开发了一种由脱细胞脊髓细胞外基质(dECM)与动态HAMA/Alg-Ca²⁺网络组成的双重仿生可三维(3D)打印水凝胶支架(HDA)，以更好重现原生脊髓特性并改善再生结果。该系统关键特征在于整合dECM来源生化线索与力学适应性水凝胶网络。dECM提供支撑细胞黏附与迁移的天然细胞外成分，而双交联HAMA/Alg-Ca²⁺网络引入可调粘弹性与结构稳定性。该组合实现剪切稀化可注射性及足够力学完整性以维持损伤空间。相较于既往基于药物递送、结构支架或单模式仿生的策略，本系统在单一构造内整合生化与力学仿生。此外其3D打印性实现病变特异性结构适配，利于不规则SCI缺损。体内结果显示HDA治疗改善内源性神经干细胞(NSC)招募、增强神经元分化、减少胶质瘢痕形成并促进轴突再生。这些细胞与结构变化伴随运动与膀胱功能改善。尽管结果与既往强调生化信号与力学线索在神经修复中重要性的报道一致，本研究进一步在单一工程系统内整合这些效应。转录组分析提供分子层面证据支持上述观察：HDA治疗关联神经发生、轴突导向与突触组织相关基因上调，同时炎症与纤维化反应相关基因下调。结果表明向促再生转录状态协调转变，尽管特定基因变化与功能结果因果关系需进一步验证。尽管结果令人鼓舞，仍应承认若干局限。功能恢复主要通过行为与组织学分析评估，更直接的电生理连接与长期环路整合评价将提供更强神经重建证据。此外再生组织长期稳定性与支架降解效应需进一步研究。对于临床转化，可扩展性与灭菌仍是关键考量。虽3D打印可实现精确支架制造，放大生产需工艺标准化。γ辐照等灭菌策略或适用，但其对水凝胶结构与生物活性影响需在临床应用前系统评估。总体而言，HDA水凝胶结合生化与力学仿生构建许可神经修复微环境。然而各组分相对贡献及其体内长期相互作用需进一步研究。这些结果支持双重仿生策略作为SCI修复有前景方向，同时强调进一步优化临床转化之必要。

Zhihua Wang|Jiahui Mao|Jiawei Tu|Yong Li|Han Xiao|Bohan Shen|Shaoxing Dai|Hao Duan|Lei Zhang