Prohibitin 2 是T细胞增殖、分化和效应功能的关键体内调节因子

《Communications Biology》：Prohibitin 2 is a key regulator of T cell proliferation, differentiation, and effector functions in vivo

　　

Prohibitin 2 (PHB2) 是一种高度保守的蛋白质，在不同细胞类型中对细胞稳态和存活具有重要作用。先前的研究表明，PHB2的缺失会导致由动力蛋白样GTP酶OPA1（dynamin-like GTPase OPA1）调控的线粒体功能受损，从而引起增殖停滞。PHB2在免疫细胞中的功能尚不清楚；然而，一些研究表明PHB2在B细胞和T细胞的细胞膜中发挥作用。为了阐明PHB2在免疫细胞中的作用，研究人员生成了PHB2缺陷型T细胞。研究结果揭示了PHB2在T细胞增殖和分化中的关键作用。PHB2缺失通过诱导G1期到S期的细胞周期阻滞（cell cycle arrest at the G1 to S phase）来抑制T细胞增殖，从而阻止其分化为效应T细胞。此外，与先前报道相反，缺乏PHB2的T细胞对凋亡更具抵抗力。代谢分析显示，PHB2缺陷型T细胞在激活后无法通过糖酵解（glycolysis）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）提高能量产生，从而阻碍其维持生物合成过程以及在激活后增殖的能力。

Prohibitin 2 (PHB2) 和 Prohibitin 1 (PHB1) 是高度保守的蛋白质，在从鼠胚胎成纤维细胞、肠上皮细胞、β细胞到神经元等多种细胞类型中广泛表达。PHB1 和 PHB2 在蛋白质水平上相互依赖，缺失一个会导致另一个的丧失。Prohibitins 根据其细胞定位（质膜、线粒体或细胞核）发挥并调节多种细胞功能，包括凋亡、能量代谢、增殖和衰老。在线粒体中，这两种蛋白组装在线粒体内膜上，形成一种超分子结构，调控线粒体基因组、调节线粒体动力学、形态、生物发生和线粒体固有凋亡途径。尽管线粒体 Phbs 在所有研究过的细胞类型中均存在，但在小鼠和人类中，T 细胞受体（TCR）激活的 T 细胞表面有相当一部分 PHB1 和 PHB2 表达。具体而言，PHB1 和 PHB2 在 Th17 细胞表面高表达，有助于这些效应细胞的分化。表面表达的 PHB1/2 与 Vi 多糖结合导致抑制控制 Th17 细胞可塑性的 CRAF-MAPK 信号级联反应，但这种相互作用不影响 T 细胞的增殖能力。在 T 细胞白血病细胞系 Kit255 细胞中敲低 prohibitins 导致线粒体膜电位降低。这些体外研究强烈表明 prohibitins 在 T 细胞功能中发挥作用，但体内证据仍然缺乏。在小鼠中，发育过程中丧失 PHB 复合物以及使用 Nestin-Cre 导致脑特异性 Phb2 缺失的小鼠会导致胚胎致死。产后使用 CaMKIIα 驱动的 Cre 表达在前脑敲除 PHB2 会导致神经元丢失，并在约 17 周龄时死亡。为了确定 PHB2 在 T 细胞中的功能，研究人员检查了 T 细胞特异性 PHB2 缺陷小鼠，发现 PHB2 对 T 细胞稳态、增殖、功能和 T 细胞分化至关重要。在稳态下，缺乏 PHB2 的小鼠在所有检测的外周淋巴器官中 T 细胞数量均显著减少。尽管 PHB2 缺陷型 T 细胞仍表现出典型的早期 TCR 激活迹象（如 CD25 和 CD69 表达增加），但这些初始 T 细胞无法分化为效应 T 细胞，也无法在激活后分泌效应细胞因子。此外，缺乏 PHB2 的 T 细胞表现出显著的增殖缺陷，这是由于细胞周期阻滞在 G1 到 S 期。这是由 TCR 刺激后启动 DNA 复制缺陷所致，同时伴随许多对 T 细胞增殖至关重要的蛋白质表达显著降低。因此，本研究凸显了 PHB2 在体内 T 细胞功能中的重要性。

为了研究 PHB2 在 T 细胞中的体内作用，研究人员将条件性 Phb2^F/F 小鼠与 CD4-Cre 小鼠杂交，从而在胸腺发育过程中从 CD4⁺CD8⁺ 双阳性祖细胞状态开始在所有 T 细胞中敲除 PHB2。这些小鼠简称为 Phb2^TKO。尽管 CD4-Cre 表达始于胸腺 T 细胞发育的双阳性阶段，但流式细胞术分析显示，与同窝对照相比，Phb2^TKO 小鼠的胸腺细胞数量或发育阶段（包括 CD4^-CD8^- DN、CD4⁺ SP、CD8⁺ SP 或 CD4⁺CD8⁺ DP 胸腺细胞）没有变化。此外，更早的发育阶段（DN1-DN4）也未受影响。为了了解胸腺 T 细胞为何不受 PHB2 缺失的影响，研究人员通过 MACS 纯化的 CD4⁺ 胸腺 T 细胞的 Western blot 分析检测了 CD4-Cre 介导的 PHB2 蛋白缺失。结果显示，与对照细胞相比，Phb2^TKO 胸腺细胞中 PHB2 蛋白仍然等量存在，表明 PHB2 蛋白半衰期延长。Phb2^TKO 小鼠与同窝对照小鼠的胸腺、脾脏、淋巴结和肠系膜淋巴结的总细胞数相当，无显著差异。值得注意的是，与同窝对照相比，Phb2^TKO 小鼠脾脏中 TCRβ⁺ T 细胞的百分比和总细胞数显著减少约 50%。相反，脾脏中 CD19⁺ B 细胞的百分比显著增加，但总细胞数保持不变。此外，脾脏中 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞的比例不变，但 Phb2^TKO 小鼠中 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞的总细胞数均显著减少。在淋巴结和肠系膜淋巴结中也观察到类似效应。当将 CD4⁺ T 细胞分为初始（CD62L^highCD44^low）和记忆/效应 T 细胞（CD62L^lowCD44^high）时，再次观察到显著减少。初始和中央记忆 CD8⁺ T 细胞的总细胞数也显著减少，而效应 CD8⁺ T 细胞数量不变。通过 FACS 分选的初始 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞的 Western blot 分析显示 PHB2 蛋白完全缺失。相反，Phb2^TKO 小鼠的 CD4⁺ 和 CD8⁺ 效应 T 细胞含有一些残留的 PHB2 蛋白。另一个受 CD4-Cre 介导缺失影响的 T 细胞亚群是 Foxp3⁺ 调节性 T 细胞。脾脏 Treg 细胞的流式细胞术分析显示，与对照相比，该细胞群的百分比和总细胞数均显著减少。对分选的 CD4⁺CD25⁺ T 细胞进行 Western blot 分析，显示 Treg 细胞中 PHB2 蛋白几乎完全丢失。此外，与先前发现一致，PHB2 的缺失也导致 PHB1 蛋白的丢失。总之，T 细胞中 PHB2 的缺失导致稳态下外周淋巴器官中所有 T 细胞亚群的急剧减少。这些结果表明，T 细胞中 PHB2 的缺失阻止了外周 T 细胞的适当扩增，而胸腺中的 T 细胞发育似乎正常。

为了评估 PHB2 缺陷型 T 细胞的体内功能，研究人员诱导了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。EAE 是多发性硬化症的小鼠模型，高度依赖 T 细胞效应功能。这种自身免疫反应通过注射乳化在完全弗氏佐剂中的 MOG 肽 p35-55 激活，从而激活自身免疫 T 细胞并促进其迁移至中枢神经系统。该过程导致 CD4⁺ T 细胞介导的中枢神经系统神经元髓鞘破坏。研究人员发现，与对照动物相比，T 细胞特异性缺乏 PHB2 的小鼠对 EAE 完全抵抗。为了排除旁分泌效应或因 Phb2^TKO 小鼠 T 细胞数量显著减少而产生的效应，研究人员生成了骨髓嵌合体。将从 Thy1.1 对照和 Thy1.2 Phb2^TKO 小鼠中分离的骨髓细胞以 1:1 比例注射到之前轻度辐照的 Ly5.1 小鼠中。十周后，在这些动物中诱导 EAE，测量疾病进展，并在第 15 天疾病高峰期通过流式细胞术分析小鼠。该分析显示，患病小鼠的中枢神经系统中几乎不存在 PHB2 缺陷型 CD4⁺ T 细胞，仅含有 Thy1.1 WT T 细胞。此外，MOG 回忆试验（一种针对 MOG 特异性自身免疫 T 细胞的检测）显示，MOG 特异性 PHB2 缺陷型 CD4⁺ T 细胞向中枢神经系统的浸润显著减少。这些结果表明，缺乏 PHB2 的 T 细胞无法诱导疾病，也无法对用于免疫的 MOG 肽做出反应。鉴于 Phb2^TKO 小鼠在分析年龄（8-12 周龄，SPF 条件下）保持健康，但其 T 细胞无法启动免疫反应，研究人员决定将 PHB2^fl/fl 小鼠与 Foxp3-Cre 小鼠杂交，以研究 PHB2 缺陷型调节性 T 细胞的潜在缺陷。Phb2^TregKO 小鼠表现出明显的自身炎症迹象，并因严重的炎症迹象而在出生后 22-32 天之间被处死。宏观上，Phb2^TregKO 小鼠比对照小鼠小，并出现鳞状皮肤、眼睑、耳朵和尾巴结痂，表现为 scurfy 表型。这些小鼠的淋巴结肿大，而脾脏大小与对照小鼠相似。与大小一致，Phb2^TregKO 小鼠与对照小鼠相比脾脏总细胞数不变。然而，Phb2^TregKO 小鼠的外周淋巴结总细胞数显著增加。详细的胸腺分析显示总细胞数急剧减少。流式细胞术分析显示，脾脏中 Treg 细胞的百分比显著降低，而淋巴结中的百分比不变。此外，效应 T 细胞分析显示，与对照小鼠相比，Phb2^TregKO 小鼠脾脏和淋巴结中 CD4⁺ 和 CD8⁺ 效应 T 细胞显著增加。这些结果共同类似于 scurfy 表型——一种导致 Treg 功能丧失和随后致命免疫功能障碍的 X 连锁隐性突变。这些发现共同强调了 PHB2 对 Treg 细胞功能的极端重要性。

为了公正地了解 PHB2 缺陷对 T 细胞的影响，研究人员对来自 Phb2^TKO 和对照小鼠的 MACS 纯化脾脏初始 CD4⁺ T 细胞在稳态和 α-CD3/α-CD28 刺激 24 小时后进行了比较蛋白质组学分析。在稳态下，Phb2^TKO 小鼠的 T 细胞与对照小鼠的 T 细胞显著不同。在未刺激的 PHB2 缺陷型初始 CD4⁺ T 细胞中，与对照初始 T 细胞相比，有 21 个肽段显著下调，30 个肽段上调。在 α-CD3/α-CD28 TCR 刺激 24 小时后，与对照 T 细胞相比，PHB2 缺陷型 T 细胞中有 11 个肽段显著下调，69 个肽段上调。其中，21 个肽段在未刺激和刺激条件下均显著改变。令人惊讶的是，这 21 个肽段在两种条件下的表达水平变化完全相同，表明刺激本身并未影响这些肽段的表达。该分析还揭示了转基因 T 细胞中 PHB2 和 PHB1 的缺失。在稳态和刺激后，annexin A2（Anxa2）——一种已被报道直接与 PHB1 和 PHB2 相关的蛋白——在 PHB2 缺陷型 T 细胞中上调。在 α-CD3/α-CD28 刺激后，ATP 依赖性锌金属蛋白酶 YME1L1 在 PHB2 缺陷型 T 细胞中下调。YME1L1 与 OMA1 共同切割 OPA-1，导致 S-OPA1/L-OPA1 比例失衡，这种失衡是 PHB2 缺陷下观察到的线粒体碎片化表型的原因。YME1L1 在 PHB2 缺陷型 T 细胞中的下调表明了一种潜在的补偿机制。该数据集进一步使用 Ingenuity 通路分析（IPA）进行分析。该通路分析未发现与增殖、代谢或 T 细胞相关的显著调控通路。然而，在稳态和刺激后，PHB2 缺陷型 T 细胞中 tRNA 负载途径显著上调，该途径由 tRNA 合成酶（介导氨基酸负载到 tRNA 的连接酶）组成。此外，IPA 的功能分析显示，与对照细胞相比，PHB2 缺陷型 T 细胞中与 T 细胞激活和 T 细胞发育相关的肽段表达增加。研究人员手动注释了数据集，发现了一组与细胞增殖相关的肽段：有 9 个差异表达肽段与增殖和细胞周期进展相关，其中 5 个有直接参与 T 细胞增殖的迹象。所有这些肽段的调控方式均会对 T 细胞增殖产生负面影响。在这些蛋白中，HELLS（一种建立 DNA 甲基化模式的解旋酶）已被报道影响外周淋巴细胞稳态和 T 细胞增殖，但尚未与 prohibitins 关联。总之，这些数据表明 PHB2 在 T 细胞中具有促增殖作用，因为增殖必需蛋白的下调被观察到。

为了确定蛋白质组学数据中观察到的增殖相关蛋白下调是否导致 PHB2 缺陷型 T 细胞的增殖缺陷以及随后所有外周 T 细胞亚群的减少，研究人员用紫色细胞示踪剂标记初始 CD4⁺ T 细胞，并通过 TCR 激活。此外，添加细胞因子混合物诱导其向 Th1、Th17 或 Treg 细胞分化。在 Th0 条件、Th17 和 Treg 细胞条件下均检测到 PHB2 缺陷型 T 细胞的严重增殖缺陷。为了进一步表征 Th 细胞效应功能，研究人员检测了 Phb2^TKO 和对照小鼠 CD4⁺ T 细胞的细胞因子分泌。初始 CD4⁺ T 细胞向 Th17 和 iTreg 分化四天后，与对照细胞相比，PHB2 缺陷型 T 细胞中 IL-17A⁺ 和 Foxp3⁺ 细胞显著减少。由于仍有一小部分从 PHB2 缺陷小鼠中分离的 T 细胞能够增殖，研究人员分析了这些细胞是否可能逃脱了 CD4-Cre 介导的 PHB2 缺失。因此，FACS 分选了 CFSE^low T 细胞（强增殖）和 CFSE^high T 细胞（未增殖）进行 Western blot 分析 PHB2 表达。结果显示，确实，少数能够增殖的 T 细胞仍表达 PHB2，并逃脱了 Cre 介导的重组。因此，PHB2 缺陷在体外强烈抑制 T 细胞增殖。为了研究 PHB 在 T 细胞激活和增殖过程中是否上调，研究人员分离了野生型 T 细胞，并使其未刺激或接受不同 T 细胞激活刺激。结果显示，野生型 T 细胞在响应激活时上调 PHB2 表达，表明 PHB2 在 T 细胞激活和增殖中发挥作用。这些数据与先前在其他细胞中 PHB2 对增殖至关重要的报道一致。为了评估体外观察到的增殖缺陷是否也能在体内条件下体现，研究人员将不同同种异型标记的 MACS 分选 VCT 标记的初始 CD4⁺ T 细胞（对照 T 细胞 CD45.1⁺ 和 Phb2^TKO T 细胞 CD45.2⁺）以 1:1 比例共转移到 RAG2^-/- 小鼠中。六天后，通过流式细胞术分析 RAG2^-/- 小鼠脾脏中的 T 细胞。对照 CD45.1⁺ T 细胞占 RAG2^-/- 小鼠脾脏中所有 CD90.2⁺ T 细胞的 77.6%，而 PHB2 缺陷型 CD45.2⁺ T 细胞占 21.4%。VCT 染色显示对照 CD45.1⁺ T 细胞在 RAG2^-/- 小鼠中成功增殖，而 CD45.2⁺ PHB2 缺陷型 T 细胞未增殖。为了确定 PHB2 缺陷小鼠外周 T 细胞显著减少是否归因于细胞周期特定阶段的阻滞，研究人员对初始 CD4⁺ T 细胞进行了碘化丙啶染色，这些细胞用 α-CD3/α-CD28 刺激三天。该分析显示 PHB2 缺陷型 T 细胞完全无法启动 DNA 复制。此外，刺激三天后 PHB2 缺陷型 T 细胞中 Ki-67 染色的缺失表明细胞周期进展在 G1 到 S 期转变时受阻，因为 Ki-67 在进入 S 期时上调。蛋白质组学数据揭示，在刺激的 PHB2 缺陷型 T 细胞中增殖相关蛋白下调。有趣的是，其中一个识别出的蛋白 HELLS 与 UHRF1 一起被报道受 Rb/E2f 家族调控，直接参与视网膜母细胞瘤发生。同时，UHRF（也建立 DNA 甲基化模式）在 α-CD3/α-CD28 刺激的初始 CD4⁺ T 细胞中也显著下调。因此，研究人员询问对 G1 到 S 期转变至关重要的 Rb/E2f 轴是否在 PHB2 缺陷型 T 细胞中差异调控。在未刺激的对照和 PHB2 缺陷型 T 细胞中均未检测到 HELLS 蛋白，而 α-CD3/α-CD28 刺激后，对照 T 细胞中 HELLS 显著上调。相反，从 Phb2^TKO 分离的初始 CD4⁺ T 细胞在刺激后无法上调 HELLS 表达，表明 PHB2 在 HELLS 蛋白稳态调控中发挥作用。此外，Western blot 分析显示，与对照 T 细胞相比，TCR 刺激的 PHB2 缺陷型初始 CD4⁺ T 细胞中 Rb 蛋白磷酸化水平较低。Phb2^TKO 小鼠 T 细胞数量减少的另一个可能解释是凋亡敏感性增加，导致试图进入 S 期的细胞死亡。然而，用 α-CD3/α-CD28 刺激两天的 PHB2 缺陷型 T 细胞的 Annexin V 染色显示，与对照相比，凋亡细胞、前凋亡细胞或活细胞没有差异。令人惊讶的是，与对照细胞相比，PHB2 缺陷型 T 细胞中的死细胞显著减少。总之，PHB2 缺陷型 T 细胞无法增殖，随后无法分化为效应 T 细胞亚群。凋亡作为细胞计数减少和增殖缺陷的解释可以被排除，因为 PHB2 缺陷型 T 细胞在刺激后并未表现出凋亡敏感性增加，这与先前报道的其他 PHB2 缺陷细胞类型相反。它们在增殖过程中无法进入 S 期以及 RB 磷酸化减少，表明细胞周期进展在 G1 到 S 期转变时普遍受阻，从而阻碍激活 T 细胞的增殖和分化。

T 细胞激活、增殖以及分化为效应和记忆 T 细胞涉及 T 细胞大小、分子含量的大规模重塑，并产生对能量和氨基酸的巨大需求。通常，T 细胞激活导致细胞大小增加，也称为 blasting。PHB2 缺陷型 T 细胞对 TCR 刺激和 T 辅助细胞亚群细胞因子混合物的增殖缺陷表明可能 TCR 信号及其共刺激受体 CD28 下游存在改变。为了测试 PHB2 缺陷型 T 细胞在 TCR 激活后是否能 blasting，将 MACS 纯化的初始 CD4⁺ T 细胞未处理或在 α-CD3/α-CD28 刺激下培养一或两天。FACS 分析显示，PHB2 缺陷型 T 细胞在刺激后一天未增加大小，并且与对照 T 细胞相比，在刺激两天后增加细胞大小的效率较低。T 细胞的初级激活由 TCR 与抗原呈递细胞的 MHC II 分子结合介导，导致 Ca²⁺ 快速涌入细胞质。研究人员使用钙敏感染料 Fluo-4 和 FuraRed 通过流式细胞术测量钙流。PHB2 缺陷型初始 CD4⁺ T 细胞在 CD3 和 CD4 交联后的钙流与对照 T 细胞相比无显著差异。T 细胞的长期激活导致激活标志物如 CD69 和 CD25 上调。与对照 T 细胞相比，PHB2 缺陷型 T 细胞在 α-CD28/α-CD28 TCR 刺激 24 小时后 CD25 表达无差异，而 CD69 表达甚至增加。这表明 PHB2 缺陷型 T 细胞保留了 TCR 下游的功能性信号传导。通过 CD28 的次级激活还诱导 IL-2 的产生和分泌，IL-2 是一种生存和促增殖细胞因子。研究人员通过 ELISA 测量了初始