酶触发葡萄糖释放支架作为毫米级组织工程的营养支持

《Materials Today Bio》：Enzymatically Triggered Glucose-Releasing Scaffolds as Nutritional Supports for Millimeter-Scale Tissue Engineering

　　

构建毫米级组织以模拟真实人体组织或器官仍具有挑战性，因为氧气和营养物质从血管的扩散极限仅为100–200 μm。除红细胞和血小板外，几乎所有哺乳动物细胞都需要葡萄糖供应以支持其代谢活动和功能。受血管特性的启发，研究人员开发了一种海藻酸钠（SA）支架，该支架通过淀粉葡糖苷酶（AMG）等酶水解糖原（GLY）来释放葡萄糖。该支架可灵活成型为释放葡萄糖的胶囊（Glc-RCs）和释放葡萄糖的纤维（Glc-RFs）。实验证明，Glc-RCs可提供长达4天的持续葡萄糖释放，且对C2C12小鼠成肌细胞和人脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）的增殖无负面影响。Glc-RCs还可在无需更换培养基的情况下，支持C2C12在应用7天后分化成肌管。Glc-RFs被整合到毫米级三维（3D）组织工程构建体中，从而降低了距纤维约1000 μm范围内的正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）的凋亡活性。值得注意的是，葡萄糖扩散距离与由此产生的细胞反应（如凋亡）之间的关系在其他葡萄糖释放材料研究中尚未有报道。因此，所开发的葡萄糖释放支架可通过3D挤出打印成型为不同尺寸，作为局部葡萄糖递送系统，用于进一步研究葡萄糖扩散曲线，并为支持毫米级组织构建提供葡萄糖。

**研究背景、现存问题与研究目的**
构建具有毫米级厚度的功能性组织是组织工程领域的核心挑战之一。由于血管系统的扩散限制，氧气和葡萄糖等小分子营养物质仅能渗透约100–200 μm，导致超过这一尺寸的组织内部细胞因营养匮乏而凋亡或坏死。目前，为解决这一问题，研究人员尝试了多种策略，例如在组织中预构建血管网络，但该方法在工艺复杂性和均一性上仍面临困难；另一种方法是制备氧气释放材料，如基于过氧化钙（CaO₂）的支架，但葡萄糖作为细胞能量代谢的关键底物，其持续供应也同样重要。现有葡萄糖释放材料主要依赖多糖（如淀粉）的酶解，但存在葡萄糖释放持续时间短、酶易泄漏或葡萄糖前体溶解度低等问题。因此，开发一种能持续、可控地释放葡萄糖且无细胞毒性、可灵活成型为不同形状的支架，对于支持毫米级组织构建具有重要的科学意义和应用价值。该研究论文发表在《Materials Today Bio》。

**主要关键技术方法**
研究人员利用海藻酸钠（SA）作为主要基质材料，通过钙离子（Ca²⁺）交联形成水凝胶。将糖原（GLY）作为葡萄糖来源，以及淀粉葡糖苷酶（AMG）作为水解酶共同封装在SA水凝胶中，通过酶解反应释放葡萄糖。通过调节SA和CaCl₂浓度优化封装效率，并利用荧光标记法追踪AMG和GLY的保留率。通过手动挤出法制备不同形状的支架，包括葡萄糖释放胶囊（Glc-RCs）和葡萄糖释放纤维（Glc-RFs）。在细胞实验中，使用C2C12小鼠成肌细胞系、原代人脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）和正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）进行体外培养和功能评估，通过免疫荧光染色、细胞计数和凋亡分析等手段评价支架对细胞的作用。

**研究结果**
1. **GLY溶液酶解研究**：通过比较麦芽糊精、右旋糖酐和GLY的酶解效率，发现GLY因含有α-1,4糖苷键且具有较高的水溶性和分子量，更适合作为葡萄糖来源。在HEPES缓冲液（pH 7.4，37°C）的生理条件下，30 mg/mL GLY溶液经20 μg/mL AMG酶解1小时后可产生约25 μmol葡萄糖。
2. **Glc-RCs封装系统优化**：使用80 mg/mL SA和200 mg/mL CaCl₂交联可获得最佳的AMG和GLY封装效率（分别为79%和90%）。在10天的酶解反应中，GLY几乎完全降解并释放，而AMG仍有部分保留。葡萄糖释放量可通过调节AMG浓度进行控制，并且在封装状态下，AMG的酶活性并未降低，90–100%的GLY被转化为葡萄糖。
3. **Glc-RCs对细胞增殖和分化的影响**：在无葡萄糖培养基中加入30个Glc-RCs可使C2C12细胞增殖至初始数量的172%，而完全无葡萄糖条件下细胞存活率降至85%。Glc-RCs还能支持C2C12细胞在7天内分化为肌管，其融合指数（12.9%）与25 mM高糖培养基（15.2%）无显著差异。此外，Glc-RCs也能支持原代ADSCs的增殖，达到25 mM葡萄糖组（423%）的382%。
4. **Glc-RFs对3D组织工程构建体中NHDFs形态和凋亡的影响**：将Glc-RFs嵌入含有NHDFs的纤维蛋白凝胶中，构建4 mm厚的3D组织。结果显示，距Glc-RFs小于1000 μm的区域，NHDFs的凋亡活性仅为2.83%，而距纤维大于1000 μm的区域凋亡活性高达30.47%。这表明Glc-RFs建立了局部葡萄糖梯度，能有效抑制近距离细胞的凋亡。此外，葡萄糖的存在还使NHDFs的形态更趋于圆形，细胞延伸减少。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，所开发的葡萄糖释放材料成功利用了GLY的酶解，相比其他多糖，GLY因高水溶性和高保留率而更具优势。Glc-RCs能持续释放葡萄糖长达4天，显著优于此前仅能维持数小时的研究。通过调节水凝胶的交联密度，可进一步提高葡萄糖释放的持续时间。与Glc-RCs相比，Glc-RFs因其较小的表面积与体积比，葡萄糖释放速率更慢，10天后仅降解了46%的GLY，理论上可提供更长时间的葡萄糖供应。

研究结论：本研究成功开发了一种基于AMG酶解GLY的葡萄糖释放材料。该材料可灵活成型为胶囊或纤维，并展现出良好的生物相容性，能够支持C2C12和ADSCs的增殖及C2C12的分化。更重要的是，在毫米级3D组织构建体中，Glc-RFs产生的局部葡萄糖梯度可将距纤维1000 μm以内NHDFs的凋亡活性降低至2.83%，而远端区域则为30.47%。这一发现首次揭示了葡萄糖扩散距离与细胞凋亡之间的关系，为后续构建更大尺寸的组织工程产品提供了新的营养支持策略。该材料还具有应用于培养肉等食品领域的潜力。