通过过敏原监测提升狂犬病疫苗安全性：一种用于测定β-丙内酯灭活后纯化原料中残留人血清白蛋白的时序荧光免疫分析法

《Micron》：Enhancing rabies vaccine safety through allergen monitoring: A time-resolved fluoroimmunoassay for quantifying residual HSA in purified bulk material after β-propiolactone inactivation

　　

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  首个用于测定经β-丙内酯灭活后的狂犬病疫苗纯化原料中残留人血清白蛋白的TRFIA检测方法。
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  该检测方法灵敏度高（检出限为0.15纳克/毫升），特异性强，且检测范围宽（最高可达1000纳克/毫升）。
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  填补了狂犬病疫苗生产过程中监测BPL处理后人血清白蛋白的质量控制空白。
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  可通过降低潜在过敏原暴露风险，提升疫苗接种的安全性。

引言

狂犬病是一种由狂犬病毒引发的致命人畜共通疾病，每年导致约59,000人死亡，其中大部分发生在亚洲和非洲，15岁以下的儿童占死亡人数的40%[1]。尽管狂犬病的死亡率在所有已知传染病中位居首位，但通过及时接种疫苗完全可以预防，而疫苗接种仍是暴露前和暴露后预防最有效且最安全的措施[2][3][4]。

现代狂犬病疫苗主要是利用细胞培养获得的病毒抗原，再通过β-丙内酯进行灭活处理后制成[5][6][7]。在疫苗生产流程中，纯化原料属于关键中间产物——它是经过灭活处理的多批原料混合后的混合物，之后才会进一步加工成最终疫苗。这类混合原料可能由多批原料组成，也能生成多批最终疫苗产品。在β-丙内酯灭活过程中，该物质会不可逆地改变病毒核酸的结构，同时与生产过程中的蛋白质发生反应。人血清白蛋白作为细胞培养基及最终疫苗配方中的常用稳定剂，在经过β-丙内酯处理后也会发生结构变化[8]。因此，经β-丙内酯修饰的人血清白蛋白残余物可能会残留在纯化原料中，进而存在于最终疫苗产品中。

先前的研究表明，β-丙内酯处理过的人血清白蛋白在初次免疫时可能作为过敏原，促使免疫系统产生特定的IgE抗体。当人体再次接触该过敏原时，就可能引发类似血清病的过敏反应，从而导致疫苗接种失败，影响疫苗安全性[9][10][11][12]。对于狂犬病疫苗而言，这一风险尤为突出，因为标准的灭活疫苗接种方案需要连续接种4到5剂。由于在任意一剂加强针接种时都可能存在再次接触过敏原的情况，因此在此期间出现的过敏反应就可能导致疫苗接种失败，进而阻碍全球狂犬病防控工作的推进[13]。目前，包括世界卫生组织制定的标准在内的狂犬病疫苗质量控制规范，虽然对宿主细胞蛋白和DNA的残留量有严格限制，但尚未针对纯化原料中经β-丙内酯修饰的人血清白蛋白制定具体检测要求及稳定的分析方法。因此，亟需一种灵敏度高、特异性强且具备定量功能的检测方法，用于测定狂犬病疫苗纯化原料中的此类修饰人血清白蛋白。

现有的检测人血清白蛋白的方法包括高效液相色谱法、电化学分析法、液相色谱-串联质谱法以及荧光检测法，这些方法主要用于检测血液制品中的人血清白蛋白，要么成本较高，要么检出限无法满足检测疫苗残留物的需求。目前尚无成熟的检测灭活疫苗中残留人血清白蛋白的方法[14][15][16][17][18][19][20]。与上述方法相比，时间分辨荧光免疫分析法已被开发出来，并被应用于狂犬病疫苗糖蛋白、核蛋白、Vero细胞杂合蛋白以及狂犬病病毒颗粒完整性的质量控制分析中[21][22][23][24]。由于其准确度高、线性范围广且操作简便等优点，逐渐成为狂犬病疫苗质量控制的理想分析工具。如图1和图2A所示，本研究制备了针对人血清白蛋白的配对抗体，以此建立不受β-丙内酯修饰影响的 time-resolved荧光免疫分析法，用于检测狂犬病疫苗纯化原料中的人血清白蛋白含量。经过优化后，该检测体系最终确定，其最低检出限、准确度和精密度等性能也得到了评估。通过β-丙内酯处理过的人血清白蛋白样本的检测验证，该方法也能准确测定疫苗中的这类修饰人血清白蛋白浓度。

章节要点

材料与仪器

狂犬病疫苗样品、蛋白质含量测定国家标准品（批次编号：270009-202109，浓度：19.72毫克/毫升）、Vero细胞蛋白标准品（批次编号：250022-201901，浓度：2.6微克/毫升）以及原代仓鼠肾细胞蛋白标准品（批次编号：250024-201901，浓度：4微克/毫升）均购自中国北京国家食品药品监督管理总局。Sp2/0细胞则储存在实验室医学学院的抗体工程研究所。

抗体组合的筛选与鉴定

如图3A所示，展示了接种人血清白蛋白后小鼠的血清效价情况。图3B则显示了通过间接TRFIA技术鉴定出抗人血清白蛋白阳性杂交瘤克隆的结果。最终通过杂交瘤技术获得了4种抗人血清白蛋白单克隆抗体（A010、L015、A018和C029）。相关的详细数据见补充表S1和S2。

采用前述4种抗人血清白蛋白单克隆抗体，通过矩阵法筛选出最佳组合。如图3C所示，荧光信号

讨论

狂犬病疫苗纯化原料中存在人血清白蛋白，这与它在疫苗生产过程中的双重作用有关。首先，人血清白蛋白是Vero细胞培养基中的重要成分，它既可以作为生物活性物质的载体，也能螯合重金属，同时还具有稳定作用，有助于病毒复制并维持较高的病毒滴度[26][27][28]。其次，人血清白蛋白还对狂犬病病毒颗粒在水中的分散稳定性起着关键作用。

作者贡献说明

贾光如：论文撰写——初稿撰写、方法验证、数据整理。李佳：方法验证、实验资源准备、方法设计。林继宇：方法验证。钟巧艺：数据整理。曹守春：论文撰写——审阅与编辑、项目资金申请。吴英松：项目管理工作、研究构思。林冠峰：论文撰写——审阅与编辑、项目管理工作、研究构思。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了广州市科技计划项目的支持（项目编号：202102020804）。

Kuangrou Jia|Jia Li|Jiyu Lin|Qiaoyi Zhong|Shouchun Cao|Yingsong Wu|Guanfeng Lin