PTEN的蛋白磷酸酶活性对胚胎发育和肿瘤抑制有贡献的证据

《Cancer Science》：Evidence That the Protein Phosphatase Activity of PTEN Contributes to Embryonic Development and Tumor Suppression

　　

PTEN（第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）是一种肿瘤抑制因子，其功能在多种癌症中受损。它具有磷酸肌醇脂质磷酸酶活性，通过该活性抑制致癌PI3K（磷酸肌醇3-激酶）信号网络的激活，但在体外也显示出对蛋白质底物的活性，并能够使其Thr366残基自身去磷酸化。在这里，研究人员生成了表达PTEN-Y138L的种系敲入小鼠，这是一种选择性缺乏蛋白磷酸酶活性但保留脂质磷酸酶活性的突变酶。纯合子Pten^Y138L/Y138L小鼠在E10.5之前在子宫内死亡。仅具有单个Pten^Y138L等位基因的原代MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）和胸腺细胞显示出正常的低水平AKT（蛋白激酶B）磷酸化，表明内源性PTEN-Y138L在体内有效调节PI3K信号。杂合子Pten^+/Y138L小鼠与野生型同窝小鼠相比总生存期缩短，并在多个器官中发生肿瘤。研究人员的数据表明，除了其脂质磷酸酶活性外，PTEN的蛋白磷酸酶活性也是正常胚胎发育和肿瘤抑制所必需的。

**研究背景与问题**

PTEN（第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）是一种关键的肿瘤抑制因子，其功能缺失在多种人类散发性肿瘤中极为常见。PTEN的主要功能是通过其磷酸肌醇脂质磷酸酶活性，去磷酸化PIP₃（磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸）和PI(3,4)P₂（磷脂酰肌醇3,4-二磷酸），从而抑制致癌的PI3K（磷酸肌醇3-激酶）-AKT（蛋白激酶B）信号网络。然而，PTEN在体外也表现出对蛋白质底物的弱但稳健的磷酸酶活性，并能自身去磷酸化其C末端Thr366残基。尽管已有研究提出了PTEN的多种潜在蛋白底物，但这些蛋白磷酸酶活性的体内生理意义仍不明确。目前存在的问题是：PTEN的蛋白磷酸酶活性是否在胚胎发育和肿瘤抑制中发挥独立于脂质磷酸酶活性的作用？此前的研究主要聚焦于脂质磷酸酶活性，而蛋白磷酸酶功能的体内证据不足。为此，研究人员利用一种选择性缺失蛋白磷酸酶活性但保留脂质磷酸酶活性的PTEN-Y138L突变体，在体内探究其功能。该研究发表于《Cancer Science》。

**研究方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）基因敲入小鼠模型：通过同源重组在C57BL/6J背景小鼠的Pten基因第5外显子引入Y138L点突变（c.412CA>T, c.413T>G），生成种系Pten^Y138L敲入小鼠；2）免疫印迹分析：检测PTEN蛋白表达水平及PI3K-AKT信号通路关键组分（如AKT、FOXO1、PRAS40、S6）的磷酸化状态；3）质谱法：精确测量小鼠胸腺细胞中PIP₃的绝对含量；4）组织病理学分析：对小鼠组织进行苏木精-伊红染色，由病理学家评估肿瘤类型；5）体外磷酸酶活性测定：使用放射标记的PtdIns(3,4,5)P₃和多聚GluTyr底物分别检测脂质和蛋白磷酸酶活性。样本来源包括C57BL/6J背景的基因修饰小鼠、E13.5胚胎来源的MEFs以及5周龄小鼠的胸腺细胞。

**研究结果**

*3.1 PTEN-Y138L在培养细胞中与PTEN-WT一样有效抑制AKT磷酸化*

通过在U-87 MG胶质瘤细胞、MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞和HCT116结直肠癌细胞（PTEN敲除）中表达不同剂量的PTEN-WT或PTEN-Y138L，研究人员发现两者均能剂量依赖性地降低AKT、FOXO1、PRAS40及S6核糖体蛋白的磷酸化水平，且无显著差异。这表明PTEN-Y138L的脂质磷酸酶活性足以有效抑制PI3K信号网络。

*3.2 纯合子PTEN-Y138L小鼠在子宫内死亡*

通过Pten^+/Y138L小鼠互交，未获得任何纯合子后代。胚胎发育分析显示，纯合子Pten^Y138L/Y138L胚胎在E8.5时缺乏前神经褶，体型较小；E9.5时未能完成胚胎转向；E10.5时被子宫吸收，表明胚胎致死性发生在E9.5之后。

*3.3 Pten^Y138L小鼠的特征*

杂合子Pten^+/Y138L小鼠的肝脏组织中PTEN表达水平介于野生型和Pten^+/?小鼠之间。通过将Pten^+/Y138L与携带Pten^flox条件性等位基因的小鼠杂交，并利用Cre重组酶删除野生型Pten等位基因，获得的MEFs中仅表达PTEN-Y138L，其AKT磷酸化水平显著低于完全缺失PTEN的Pten^flox/flox MEFs，表明PTEN-Y138L在体内仍能有效抑制PI3K信号。

*3.4 Pten^+/Y138L小鼠总生存期降低*

与野生型同窝小鼠相比，Pten^+/Y138L小鼠总生存期显著缩短，雌性中位生存期468天，雄性586天，但长于Pten^+/?小鼠（雌性199天，雄性229天）。Pten^+/Hyp低表达小鼠的生存期与野生型相似。

*3.5 Pten^+/Y138L小鼠在多个器官中发生肿瘤*

尸检和组织病理学分析显示，Pten^+/Y138L小鼠在多个器官出现肿瘤，包括肠系膜淋巴结B细胞淋巴瘤（21/26雌性，8/23雄性）、外周淋巴结B细胞淋巴瘤（18/26雌性，6/23雄性）、子宫内膜增生（8/26雌性）、乳腺癌（3/26雌性）、前列腺癌（1/23雄性）以及肾上腺嗜铬细胞瘤等。肿瘤谱与Pten^+/?小鼠相似但发生延迟。

*3.6 蛋白磷酸酶活性缺失不会导致T细胞白血病*

通过Lck-Cre在T细胞中特异性删除Pten^flox等位基因，研究人员比较了Pten^Flox/Y138L Lck-Cre（仅表达PTEN-Y138L的T细胞）与Pten^Flox/Flox Lck-Cre（完全缺失PTEN）小鼠的表型。Pten^Flox/Y138L Lck-Cre小鼠的胸腺细胞中AKT磷酸化水平正常，PIP₃含量未升高，且在300天观察期内未发生T细胞淋巴瘤。而Pten^Flox/Flox Lck-Cre小鼠在约16周龄时发生侵袭性T细胞淋巴瘤，伴随AKT/mTOR信号激活。这表明T细胞淋巴瘤的发生依赖于PIP₃水平升高和PI3K-AKT信号激活，而非蛋白磷酸酶活性。

**讨论与结论**

本研究表明，纯合子Pten^Y138L/Y138L小鼠在胚胎发育早期死亡，杂合子Pten^+/Y138L小鼠总生存期缩短并发生多器官肿瘤，尽管其脂质磷酸酶活性正常且能有效抑制AKT磷酸化。这些结果直接证明了PTEN的蛋白磷酸酶活性在正常胚胎发育和肿瘤抑制中不可或缺。研究人员通过对比Pten^+/Hyp低表达小鼠，排除了PTEN-Y138L不稳定导致蛋白剂量不足的干扰。结论部分指出：“我们的数据表明，除了其脂质磷酸酶活性外，PTEN的蛋白磷酸酶活性也是正常胚胎发育和肿瘤抑制所必需的。”这一发现揭示了PTEN双重磷酸酶活性协同作用的机制，可能涉及自身去磷酸化调控或对异源蛋白底物的去磷酸化，为理解PTEN在肿瘤抑制中的完整功能提供了新视角，并为靶向PTEN缺失肿瘤的PI3K-AKT通路抑制治疗策略提供了理论依据。