液相色谱-串联质谱定量饮食来源的CYP2D6生物标志物用于日本受试者的临床表型分析

《Clinical and Translational Science》：Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Quantification of Diet-Derived CYP2D6 Biomarkers for Clinical Phenotyping in Japanese Subjects

　　

细胞色素P450 2D6（CYP2D6）的酶活性表现出显著的个体间差异，这影响药物疗效和多种治疗药物的不良反应风险。虽然当前用于CYP2D6基因分型或CYP2D6表型分析的方法提供了有用信息，但仍需要更少侵入性且更简单的工具来评估个体间功能差异。近期，solanidine（SND）及其代谢物被提议作为CYP2D6活性的生物标志物。在本研究中，研究人员建立了一种经过验证的分析方法，用于定量SND及其代谢物。此外，评估了它们在预测日本人群中CYP2D6活性方面的实用性。研究人员合成了4-hydroxysolanidine（4-OHSND）并确认其结构，开发了一种液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）方法，用于同时测定SND、4-OHSND和3,4-seco-solanidine-3,4-dioic acid（SSDA）。该方法应用于94名参与者的血浆样本，以研究CYP2D6基因型。4-OHSND与SND的比值以及SSDA与SND的比值在预测的CYP2D6表型组之间显示出显著差异，在弱代谢者（PMs）中显著降低。受试者工作特征分析显示完全区分PMs（AUC?=?1.00）。相比之下，SND生物标志物与某些他莫昔芬代谢比值之间发现了弱正相关。这些发现证实了4-OHSND的结构身份和定量可检测性，并支持其作为CYP2D6 PM检测的实用生物标志物的潜力。尽管需要在更大和更多样化的队列中进行验证，但饮食来源的生物标志物可能代表一种微创替代基因分型或探针药物的方法，并可能有助于广泛实施表型指导的个体化医疗。

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**研究背景与问题**

细胞色素P450 2D6（CYP2D6）是一种主要药物代谢酶，代谢约20%的临床常用药物。CYP2D6基因具有高度多态性，其遗传变异导致酶活性显著差异，进而影响药物疗效和不良反应风险。目前，临床药物遗传学实施联盟（CPIC）推荐基于CYP2D6活性对多种药物（如他莫昔芬[TAM]、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、β受体阻滞剂、阿托莫西汀、昂丹司琼、阿片类药物和三环类抗抑郁药）进行剂量调整，将患者分为正常代谢者（NM）、中间代谢者（IM）、弱代谢者（PM）或超快代谢者（UM）。CYP2D6活性可通过基因分型或基于探针药物的表型分析进行评估，但基因分型需要复杂的外显子测序和拷贝数测定，且成本高、周转时间长；探针药物法则需额外用药，增加患者负担。近年来，饮食来源的CYP2D6生物标志物——solanidine（SND）及其代谢物（4-hydroxysolanidine [4-OHSND] 和 3,4-seco-solanidine-3,4-dioic acid [SSDA]）——作为微创替代方法受到关注。然而，这些研究主要集中在西方人群，日本人群的马铃薯摄入量较低（约为西方人群的30%–40%），且4-OHSND的结构尚未完全确认，缺乏基于绝对定量的验证方法。因此，研究人员旨在评估日本人群中SND、4-OHSND和SSDA（或其比值）作为CYP2D6活性预测标志物的实用性，并建立对应的分析方法。

**研究内容与结论**

研究人员合成了4-OHSND，开发并验证了同时定量SND、4-OHSND和监测SSDA的液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）方法，并将其应用于94名日本受试者（2022年4月至2024年10月从东北大学医院招募）的血浆样本，同时进行CYP2D6基因分型。此外，对接受他莫昔芬（TAM）治疗的42名乳腺癌患者测定血浆TAM及其代谢物浓度，分析SND生物标志物与TAM代谢比值的相关性。研究证实，4-OHSND/SND浓度比值和峰面积比值以及SSDA/SND峰面积比值在PM组中显著降低，受试者工作特征（ROC）分析显示AUC达1.00，可完全区分PMs。SND生物标志物与某些TAM代谢比值（如END/NDT比值）存在弱正相关。该论文发表在《Clinical and Translational Science》。

**关键技术方法**

1. **4-OHSND合成与结构确认**：以商业SND为原料，通过二氧化硒氧化合成4-OHSND，采用核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRMS）和LC–MS/MS（保留时间与碎片离子比对）进行结构确认。2. **LC–MS/MS定量方法开发与验证**：建立同时测定SND、4-OHSND和SSDA的LC–MS/MS方法，使用胆固醇-²H₇作为内标，依据美国食品药品监督管理局（FDA）指南进行方法验证（包括线性、精密度、准确度、基质效应、稳定性）。3. **CYP2D6基因分型**：采用TaqMan实时PCR检测拷贝数变异，Sanger测序（覆盖外显子区域）鉴定等位基因变异，依据CPIC指南计算活性评分（AS）并划分表型（NM、IM、PM、UM）。样本队列来源：日本东北大学医院，94名参与者（20名男性，74名女性，平均年龄54.2岁），其中42名乳腺癌女性接受持续口服TAM治疗。

**研究结果**

**3.1 4-OHSND的合成与鉴定**：通过NMR分析观察到C-4位羟基的质子信号（δ 4.30–4.20, m, 1H），定量¹H-NMR确认纯度为27%。HRMS显示合成产物在m/z 414.3处出现质子化分子峰，无SND来源峰（m/z 398.3）。产物离子扫描显示特征碎片离子m/z 98.1。LC–MS/MS分析显示合成4-OHSND标准溶液与受试者血浆样本在相同条件下保留时间一致（3.99 min），证实血浆中m/z 414.3峰对应4-OHSND。

**3.2 CYP2D6生物标志物定量方法的验证**：SND和4-OHSND的校准曲线线性范围分别为0.01–3 ng/mL和0.3–90 ng/mL，决定系数分别为0.9957和0.9946。无残留效应。内标校正的基质因子均值在?2.92%以内，符合FDA接受标准。批内和批间精密度与准确度均达标，稳定性评估（25°C 24 h、4°C 24 h、?80°C 30天、冻融循环、自动进样器24 h）均满足要求。

**3.3 临床研究**：94名受试者的CYP2D6表型分布为：UM 0%（0例）、NM 75.5%（71例）、IM 22.4%（21例）、PM 2.1%（2例）。血浆SND浓度为0.07 ± 0.11 ng/mL，4-OHSND为7.13 ± 11.2 ng/mL。4-OHSND/SND浓度比值和峰面积比值在PM组显著低于NM和IM组（Kruskal-Wallis检验，p < 0.05；两两比较Wilcoxon秩和检验）。SSDA/SND峰面积比值在PM组也显著降低。ROC分析显示，4-OHSND/SND和SSDA/SND比值区分PMs的AUC均为1.00，灵敏度100%，特异度100%（临界值分别为1.94680和0.00497）。在42名TAM治疗者中，SND生物标志物与某些TAM代谢比值呈弱正相关，如END/NDT比值和(4-OHTAM+END)/(TAM+NDT)比值，但4-OHTAM/TAM比值无显著相关性。PM参与者表现出相对较低的TAM代谢比值。

**总结与讨论**

研究人员通过合成并结构确认4-OHSND，建立了基于绝对定量的LC–MS/MS方法，验证了SND、4-OHSND和SSDA作为日本人群CYP2D6生物标志物的可行性。研究结论：4-OHSND/SND和SSDA/SND比值可有效区分PMs（AUC=1.00），而NM与IM之间的差异仅在峰面积比值（而非浓度比值）中显著，提示这些生物标志物主要适用于PM检测。与TAM代谢的弱正相关可能受限于PM样本数量少以及TAM还经其他CYP酶（如CYP3A4）代谢。研究局限性包括：合成4-OHSND纯度仅27%，需进一步优化；UM极罕见，未评估；日本人群PM频率低，需更大样本验证。尽管如此，饮食来源的CYP2D6生物标志物提供了一种微创、实用的方法，无需基因检测或探针药物，有助于在临床中识别PM患者，支持表型指导的个体化治疗。未来需在更大且更多样化的亚洲队列中验证，并开展干预性研究以明确其临床应用价值。