血浆蛋白质组图谱分析鉴定用于神经退行性痴呆鉴别诊断与分子分期的生物标志物

《Nature Aging》：Plasma proteome profiling identified biomarkers for the differential diagnosis and molecular staging of neurodegenerative dementias

　　

血液来源的生物标志物正在成为神经退行性疾病诊断与监测的可扩展工具，但能够实现主要痴呆类型间鉴别诊断的标志物仍然有限。在此研究人员显示，大规模血浆蛋白质组学在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）、路易体痴呆（dementia with Lewy bodies, DLB）与额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD）中鉴定出疾病相关特征。研究人员分析了来自特征明确的国际队列的1318份血浆样本，并在疾病组中鉴定出超过200种失调蛋白。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）在AD连续谱中表现出最强的升高，而整合素α-V（integrin alpha-V）与整合素α-M（integrin alpha-M）在包括尸检确诊病例在内的路易体障碍中持续降低。升高的神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）与较低的GFAP与FTD相关。研究人员将这些发现转化为一个21蛋白定量多重检测面板，并在独立多中心队列（n = 805）中进行了验证。这些发现支持血浆蛋白质组学作为一种基于生物标志物的鉴别诊断与主要神经退行性痴呆疾病分期的方法。

研究背景方面，不同病因的痴呆，如阿尔茨海默病（AD）、路易体痴呆（DLB）和额颞叶痴呆（FTD），由于其症状重叠，尤其在前驱期，带来了巨大的诊断挑战，因此生物标志物对于早期准确诊断及选择合适治疗至关重要。血液生物标志物具有微创、成本效益高和易于重复采样等优势，适合大规模诊断和长期监测，目前已有有效的血液生物标志物用于检测AD的主要病理特征（即淀粉样蛋白和Tau病理），但用于AD分期或可靠识别FTD和DLB的体液生物标志物仍然缺乏，在区分AD、DLB和FTD时存在重大挑战，因为这些疾病常表现重叠临床症状和显著异质性，尤其在早期或非典型表现时，共存病理进一步模糊疾病特异性特征并降低诊断特异性。本研究发表在《Nature Aging》，研究人员旨在通过bPRIDE项目，通过对六个国际队列的血浆蛋白质组进行谱分析，识别与各痴呆类型相关的特定诊断蛋白特征，包括对照组（n = 374）及处于不同临床阶段的AD（n = 532）、DLB（n = 196）和FTD（n = 216）患者，使用大规模邻近延伸分析（proximity extension assay, PEA），并将结果转化为单一多重工具以绝对定量选定血浆蛋白，在独立队列（876份样本，含对照组n = 108，AD前驱及临床阶段n = 395，DLB n = 142，FTD n = 160）中验证，同时利用尸检确认的Vallecas阿尔茨海默项目（Queen Sofia Foundation’s Vallecas Alzheimer Project, VARS）（n = 129）的独立PEA数据评估最有前景候选物与关键神经病理标志的关联，利用帕金森病进展标志物倡议9000研究（Parkinson’s Progression Markers Initiative 9000 study, PPMI）（n = 221）的PEA数据进一步研究DLB生物标志物候选物与帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的关联。研究人员通过分析鉴定出疾病相关血浆蛋白特征，构建了21蛋白面板并验证其诊断性能，得出GFAP在AD连续谱最强升高，ITGAV和ITGAM在DLB中持续降低，NfL升高和GFAP较低与FTD相关等结论，该面板在独立队列中表现出良好判别性能，部分蛋白与神经病理标志相关且在PD中也失调，表明血浆蛋白质组学可用于主要神经退行性痴呆的鉴别诊断与分期，为临床诊断和临床研究患者分层提供支持。

为开展研究，关键技术与样本队列包括：采用大规模邻近延伸分析（PEA）进行血浆蛋白质组谱分析，涵盖探索384心脏代谢、炎症、神经学和肿瘤学面板；构建自定义21重PEA面板进行绝对定量验证；样本来源于六个国际发现队列（Amsterdam Dementia Cohort、Sant Pau Initiative on Neurodegeneration、University of Perugia、Ulm University、BioFINDER、Australian Imaging, Biomarkers & Lifestyle flagship study of ageing）及七个中心独立验证队列，同时纳入VARS尸检确认队列（n = 129）与PPMI 9000研究队列（n = 221）；通过差异表达分析、100折交叉验证最小绝对收缩选择算子（least absolute shrinkage selection operator, LASSO）回归、通路富集分析（基于KEGGREST包）、受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线评估、Spearman相关性分析及线性混合效应模型进行数据统计与建模；采用逻辑回归校正年龄、性别与多重比较，以Q值（校正后P值）判定显著性，通过校准发现队列与验证队列的绝对定量数据进行模型转移评估。

研究结果部分保留小标题并说明如下：

项目工作流程与队列描述，研究人员通过对最终bPRIDE发现队列1277名参与者（预处理后）的血浆大规模蛋白质组谱分析、质量控制、差异蛋白表达分析、机器学习、通路分析、神经病理验证及自定义靶向生物标志物面板的独立验证，总结发现队列与验证队列的人口学与临床特征，发现中心相关效应部分由组间不平衡驱动，验证队列中部分机构队列蛋白分布差异明显并单独分析。

AD血浆生物标志物的鉴定，研究人员通过血浆蛋白质组谱分析发现AD各阶段（前临床、前驱/轻度认知障碍与痴呆）相较于对照组共有236种持续失调蛋白，其中88%在AD痴呆期相较于DLB和FTD也显著改变，超过99%的蛋白在AD连续谱中下调，仅GFAP在每次比较中一致且显著升高；基于平均曲线下面积（area under the curve, AUC），在AD连续谱 versus 对照组、AD痴呆 versus DLB及AD痴呆 versus FTD中区分性能最高的蛋白为GFAP、CALCOCO1、BIN2和MAP3K5；通路富集分析显示14条通路在pre-AD、MCI-AD和AD痴呆组中至少一条显著富集（错误发现率 false discovery rate, FDR < 0.05），均较对照组下调且效应随AD进展增强，其中内质网蛋白加工、ErbB信号与线粒体自噬在三个AD临床阶段均显著下调。

AD分子分期生物标志物的鉴定，研究人员发现大多数AD特异性失调蛋白沿临床阶段呈现渐进性增加或减少，GFAP和NfL从pre-AD到AD痴呆增幅最大，MAP3K5、RET和FLT3LG降幅最显著；MAP3K5在所有AD阶段间呈显著渐进下降，RET从MCI阶段开始变化，FLT3LG在痴呆阶段特异性降低；GFAP从pre-AD到MCI-AD及MCI-AD到AD痴呆变化最显著，提示这些血浆蛋白水平可作为AD分期标志物。

DLB血浆生物标志物的鉴定，研究人员鉴定出71种DLB相较于对照组失调的血浆蛋白，其中27%在DLB相较于AD痴呆中也失调，大多在DLB中下调；基于DLB versus 对照组和AD痴呆的平均AUC，区分性能最高的为PI3及整合素家族的ITGAV、ITGAM和ITGB2；分层分析中ITGAV和ITGAM在DLB Aβ⁺与DLB Aβ^?亚组均显著降低；MCI-DLB组发现18种蛋白较对照组降低，但与MCI-AD无差异表达。未发现与DLB相关血浆蛋白的显著富集通路。

FTD血浆生物标志物的鉴定，研究人员发现FTD相较于对照组有198种蛋白失调，其中12%相较于AD痴呆也失调；效应量最大的是NfL，在FTD中相较于对照组和AD痴呆均升高，其次NCAN、NTRK3和ITGAV在FTD中降低；MCI-FTD中发现230种失调蛋白，其中30种相较于MCI-AD也失调，OSM、MMP9、CA1和BLVRB在两两比较中平均AUC > 0.77，这些蛋白未在FTD痴呆期失调蛋白中，可能仅在疾病早期改变；DLB与FTD比较仅发现四种显著失调蛋白，RGMA和DSG2在DLB升高，SELE和NfL在FTD升高，仅NfL效应量较大；未发现与FTD相关蛋白的显著富集通路。

多变量血浆生物标志物面板选择及合并症对生物标志物测量的影响，研究人员鉴于多数单标志物诊断性能AUC低于0.8，聚焦识别最少标志物以实现DLB和FTD相较于对照组和AD的特异性识别及AD分子分期，将21种标志物组合为单一PEA自定义面板，在训练集（发现队列70%）中通过100折交叉验证LASSO回归每模型最多五蛋白，确定21蛋白；多变量逻辑模型在训练集构建并在测试集（剩余30%）验证，两个血浆蛋白模型判别DLB versus 对照组和DLB versus AD痴呆在训练与测试集AUC均为0.85和0.86，ITGAV对DLB判别贡献大，ITGAM和ERBB3主要贡献于DLB versus 对照组，CD38主要贡献于DLB versus AD；FTD判别FTD versus 对照组模型AUC 0.92，NfL与B4GAT1为主要贡献；FTD versus AD痴呆仅需NfL和GFAP达到AUC 0.83；AD分期为十蛋白模型，GFAP、FLT3LG和TNFSF10为主要贡献；所有模型在训练与测试集性能相当；评估相关合并症（血脂异常、糖尿病、高血压、甲状腺功能减退、慢性肾病）对选定蛋白的影响，仅NTRK3（与肥胖相关）、PECAM1和IRAG2（均与高血压相关）显示显著合并症效应与疾病组相当或更强，但这些蛋白非痴呆类型判别主要贡献者。

自定义多重PEA血浆蛋白面板的开发与验证，研究人员为验证发现结果开发自定义PEA面板对21种选定蛋白绝对定量，显示最佳变异系数（intra-CVs和inter-CVs多数蛋白 < 20%）；在独立多中心队列（n = 722预处理后）验证，主要DLB候选物ITGAM和ITGAV在MCI-DLB和DLB中再次降低（FTD中程度较轻），主要FTD候选物NfL和OSM在FTD versus 对照中再次升高；GFAP与AD各阶段相关，在任何临床阶段区分AD与对照性能最佳（pre-AD、MCI-AD、AD痴呆 versus 对照AUC分别为0.75、0.83、0.90）；发现队列构建的模型在独立验证队列中用自定义21面板绝对定量校准后应用，判别DLB或FTD versus 对照组与发现队列相似（AUC 0.83和0.85），判别DLB或FTD versus AD略低但仍尚可（AUC 0.78和0.77），AD分期模型在验证队列性能有限，尤其pre-AD与MCI-AD区分。

血浆生物标志物面板内蛋白与独立尸检确认队列中AD和DLB神经病理标志相关，研究人员为探索bPRIDE 21重血浆痴呆面板蛋白与神经病理评分（即建立阿尔茨海默病登记联盟Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease和α-突触核蛋白α-synuclein, αSyn Braak分期）的潜在关联，分析VARS尸检确认队列（含AD、DLB和血管性痴呆，多数混合病理）生前血浆PEA Explore数据；面板中与AD和DLB最强的血浆蛋白与相应经典标志相关，AD相关蛋白（FLT3LG、RET和CDKN1A）与淀粉样斑块负荷负相关（r = ?0.2至?0.3），FLT3LG与GFAP分别与神经原纤维缠结病理相关（r = ?0.2和0.3），GFAP、NfL和TNFSF10与神经突斑块程度正相关（r = 0.31、0.23和0.17）；DLB最相关ITGAV与αSyn Braak分期病理负相关（r = ?0.22）；在VARS队列中比较伴（Braak αSyn stage > 3）与不伴（Braak αSyn stage ≤ 3）一致LBD病理的AD病例，及IBB验证队列按主要病理（LBD或AD）分层，ITGAV和ITGAM均为与LBD相关的标志物。

血浆DLB生物标志物在PD中也失调，研究人员分析PPMI 9000研究的血浆Explore PEA数据，探讨DLB血浆生物标志物是否在PD（LBD最常见临床表现）中失调；与DLB及伴LBD共病理的AD中观察一致，ITGAV和ITGAM在PD中也降低，ITGAV在PPMI队列所有PEA测量蛋白中P值最低，HPGDS（hematopoietic prostaglandin D synthase）在PD中效应次显著，在bPRIDE数据集中HPGDS在DLB versus 对照也降低（Beta = ?1.35, Q = 0.00002）但在DLB与AD痴呆间无差异故非DLB特异性；纵向PD PPMI队列（含前驱PD pro-PD）分析显示从6个月随访起ITGAV在pro-PD相较健康对照已显著降低。

讨论部分总结翻译研究结论：AD、DLB与FTD的区分仍是临床挑战，尤其在早期或非典型表现时，FTD常可依发病年龄与症状谱与AD和DLB区分但仍有重叠，AD与DLB因频繁混合病理更复杂，目前尚无识别DLB或FTD的血浆生物标志物，限制凸显了需要体液生物标志物补充临床评估、改善诊断并支持研究与治疗环境的患者选择与分层。在这项横断面多中心研究中，研究人员使用大规模PEA蛋白质组学识别用于AD、DLB和FTD鉴别诊断及AD分子分期的最小生物标志物集，并将其转化为自定义21重PEA面板在独立验证队列中验证，DLB特异性生物标志物候选物在独立尸检队列中进一步验证。与既往脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）蛋白质组学研究不同，大多数AD相关血浆蛋白相较于对照组、DLB和FTD降低，这种广泛下调见于SomaScan、质谱与近期血浆蛋白质组图谱研究，可能反映对神经退行应激的全身反应、蛋白代谢改变或其他生理紊乱；CALCOCO1、BIN2和MAP3K5是AD特异性相关最强下调蛋白，CALCOCO1与MAP3K5调节内质网介导的自噬，与三种AD阶段功能失调自噬的机制一致，BIN2参与吞噬作用并与淀粉样变性小鼠模型小胶质细胞Aβ反应相关。沿AD连续谱变化的蛋白中GFAP区分力最高，符合GFAP升高与Aβ依赖性星形胶质细胞增生及Tau病变发生的关联，但反映AD主要病理特征（Aβ和Tau病理）的蛋白在检测AD方面比GFAP更敏感特异，PEA蛋白质组学检测蛋白均未优于目前常规诊断实施的血浆生物标志物。研究人员鉴定出沿AD全连续谱渐进变化的标志物可用于AD分期，GFAP和NfL随临床阶段升高，FLT3LG、MAP3K5、PECAM1和RET随AD临床进展降低，组合为复合生物标志物得分在区分pre-AD、MCI-AD和AD痴呆中表现尚可，但在验证队列表现不佳，需未来用不同临床与生物学进展测量验证分期模型性能。后续分析聚焦DLB和FTD及其与AD的鉴别诊断，本研究在发现队列达167例DLB分析超1000种蛋白并在81例DLB中测试21选定蛋白，71种DLB相较对照失调蛋白中仅19种在DLB与AD间差异调节，包括ITGAV、ITGAM、PI3和ERBB3，其中ITGAV和ITGAM在DLB中降低且不依赖Aβ生物标志物阳性，在独立验证队列MCI-DLB和DLB、PPMI队列PD、VARS和IBB尸检LBD病理病例中亦降低，并行独立研究也报道PD中ITGAV、ITGAM和ERBB3下调，支持这些蛋白作为LBD首批血浆生物标志物的潜力；整合素介导细胞间与细胞基质相互作用，参与免疫调节、突触重塑和血脑屏障完整性，ITGAV与ERBB3形成功能信号复合物受NRG1激活，ITGAV和ERBB3协调下调可能反映LBD中NRG1介导的神经营养信号受损，导致突触功能障碍或神经元韧性降低，FTD血浆中这些整合素轻度降低与支持约三分之一FTD多巴胺能功能障碍及CSF多巴胺能障碍标志改变的证据一致。ITGAV和ITGAM个体判别DLB versus 对照和AD痴呆性能适中（AUC 0.70–0.80），多变量分类建模得到含ERBB3、ITGAV和ITGAM的5和7蛋白面板，在发现队列训练与测试集区分DLB versus AD痴呆和对照AUC ~0.85–0.86，独立验证队列AUC ~0.78–0.83。FTD中发现23种蛋白相较AD痴呆与对照失调，NfL效应量最大（vs对照），GFAP效应最显著（vs AD痴呆）；LASSO例程识别10和2蛋白特征在发现与独立验证队列较好判别FTD versus 对照和AD痴呆，主要贡献为GFAP和NfL；NfL非FTD特异性且判别FTD vs AD痴呆性能有限，GFAP可能是驱动分组判别的最强效应生物标志物，FTD中GFAP较对照升高但远低于AD，提示FTD星形细胞反应不同或较弱，GFAP在不同遗传与病理FTD亚型中差异已有报道；OSM和MMP9在MCI-FTD相较对照和MCI-AD升高，OSM在验证队列进一步验证，二者分别关联炎症反应与血脑屏障破坏，是有前景的FTD特异性血浆生物标志物候选物，探测FTD更早致病事件与NfL变化，未来需理解其在FTD复杂亚型谱中的表达。本研究局限包括DLB和FTD诊断仅基于临床评估可能存在误诊但大样本与专科单位最小化影响；不能排除AD中αSyn共病理尤其痴呆期常见；FTD组含广泛遗传与病理亚型引入异质性妨碍更多FTD血浆生物标志物识别；无法建立稳健的pro-DLB和FTD血浆生物标志物诊断模型可能因发现队列样本量较小（分别为n = 25和n = 45）与表型有限，但仍检测到有前景的单生物标志物线索（如LBD的ITGAV和ITGAM、FTD的OSM）；结果在一定程度上依赖平台，其他方法可能识别额外蛋白。尽管存在局限，研究人员在两个大型多中心队列与尸检确认病例中一致检测到关键AD、DLB和FTD相关血浆蛋白，支持发现的稳健性。总之，这项横断面多中心血浆蛋白质组研究鉴定疾病特异性血浆蛋白并建立自定义定量多重检测，实现主要痴呆原因的基于生物标志物的鉴别诊断。