ACE2 和 HR2 模拟肽抑制两种 SARS-CoV-2 变体的复制

《Journal of Medical Virology》：ACE2- and HR2-Mimetic Peptides Inhibit Replication of Two SARS-CoV-2 Variants

　　

几种抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的治疗方法集中于阻断病毒的进入机制。这可以通过两种方式阻断：与刺突蛋白的受体结合域（RBD）和人类血管紧张素转换酶2（ACE2）相互作用，以及阻断病毒-细胞膜融合。在此，研究人员设计了基于ACE2和病毒刺突茎区域的模拟肽。通过计算机模拟分子对接，研究人员选择了结合能最高的肽。肽Nat（P-Nat）和肽3（P-3）在替代ELISA检测中分别抑制了RBD-ACE2相互作用的54%和58.77%。另一方面，P-Nat和P-3在VeroE6细胞中抑制了SARS-CoV-2，对武汉株的50%抑制浓度（IC₅₀）值分别为6.28和12.79?μM，对奥密克戎株分别为6.26和7.27?μM。同时，茎模拟肽（P-K2）对奥密克戎株的IC₅₀为29.17?μM。因此，P-Nat和P-3是抑制两种SARS-CoV-2变体的良好候选物，而P-K2显示出对奥密克戎变体的抑制活性。研究人员提出，这些肽可用作病毒感染前的预防性药物，因为它们专门设计用于阻断病毒进入宿主细胞。

论文解读文章

**研究背景与问题**

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起急性与慢性感染，其奥密克戎（Omicron）变体具有高传染性和免疫逃逸能力，导致自然感染和疫苗诱导免疫的中和效果下降。现有抗病毒药物如Paxlovid（蛋白酶抑制剂）、Remdesivir（RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂）和Molnupiravir（口服抗病毒药）虽有一定疗效，但存在静脉给药限制、对奥密克戎变体效果不佳等问题。单克隆抗体也因刺突蛋白突变而对奥密克戎无效。因此，亟需开发阻断病毒进入宿主细胞的新策略。SARS-CoV-2感染的第一步是刺突（S）蛋白的受体结合域（RBD）识别宿主细胞上的血管紧张素转换酶2（ACE2），随后S2亚基的七肽重复区（HR1和HR2）介导病毒-细胞膜融合。基于此，研究人员设计了靶向RBD-ACE2互作和HR1-HR2互作的模拟肽，旨在阻断病毒结合与膜融合，从而抑制多种变体复制。

**研究内容与结论**

该研究设计并评估了三种模拟肽：ACE2模拟肽（P-Nat和P-3）和HR2模拟肽（P-K2）。通过计算机模拟分子对接筛选高结合能肽，使用替代ELISA检测RBD-ACE2结合抑制，在VeroE6细胞中通过细胞病变效应（CPE）法进行病毒中和试验，计算50%抑制浓度（IC₅₀）和50%细胞毒性浓度（CC₅₀），并评估细胞活力。结果显示，P-Nat和P-3在ELISA中分别抑制RBD-ACE2互作54%和58.77%；在病毒中和试验中，P-Nat对武汉D614G和奥密克戎BA.5.1变体的IC₅₀分别为6.28和6.26 μM，P-3分别为12.79和7.27 μM，P-K2仅对奥密克戎变体有效（IC₅₀为29.17 μM），对武汉变体未达50%抑制。细胞毒性试验表明，P-Nat和P-3在12.5 μM以下无细胞毒性，P-K2在所有测试浓度（0.78–100 μM）均无毒性。该论文发表在《Journal of Medical Virology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用计算机模拟分子对接（ICM软件）预测肽与目标蛋白（RBD或HR1）的结合模式，选择结合能最高的肽。使用替代ELISA试剂盒（RayBio COVID-19 Spike-ACE2结合检测试剂盒）评估肽对RBD-ACE2蛋白互作的抑制率。在VeroE6细胞（非洲绿猴肾细胞）中，通过CPE-based病毒微中和试验，利用中性红摄取法检测病毒感染抑制，并计算IC₅₀和CC₅₀。病毒株为武汉D614G和奥密克戎BA.5.1变体，来自标准病毒库。

**研究结果**

**3.1 分子对接**
通过分子对接分析，P-Nat与武汉株RBD形成14个相互作用（主要为氢键），结合能为-50.26 kcal/mol；P-3形成14个相互作用，结合能为-46.33 kcal/mol。与奥密克戎RBD对接时，P-Nat和P-3分别形成12和13个相互作用，结合能为-47.76和-49.14 kcal/mol。P-K2与武汉株HR1三聚体形成50个相互作用（氢键和疏水作用），结合能为-92.43 kcal/mol。结果表明，三种肽均能有效结合靶区域。

**3.2 替代ELISA检测RBD-ACE2结合抑制**
P-Nat和P-3在10 μM浓度下分别达到58.77%和54%的最大抑制率，但高于10 μM时抑制率下降，可能因溶解度限制。

**3.3 病毒中和试验**
P-Nat在12.5–50 μM浓度下完全抑制武汉D614G（100%），在12.5–100 μM完全抑制奥密克戎。P-3在25和100 μM完全抑制武汉D614G，在12.5–100 μM完全抑制奥密克戎。P-K2对武汉D614G抑制率低于50%，但对奥密克戎在50和100 μM下达到100%抑制。

**3.4 细胞活力试验**
P-Nat在0.78–12.5 μM无细胞毒性（活力接近100%），50和100 μM时分别降至54%和0%。P-3在0.78–25 μM无毒性，50和100 μM时出现毒性。P-K2在所有浓度下无毒性。

**3.5 剂量-反应曲线**
P-Nat对武汉和奥密克戎的IC₅₀分别为6.28和6.26 μM，CC₅₀为64.83 μM，选择性指数（SI）分别为10.32和10.35。P-3对武汉和奥密克戎的IC₅₀分别为12.79和7.27 μM，CC₅₀为63.84 μM，SI分别为4.99和8.78。P-K2对奥密克戎的IC₅₀为29.17 μM，CC₅₀未确定（无毒性）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，ACE2模拟肽通过阻断RBD-ACE2互作抑制病毒进入，HR2模拟肽通过干扰HR1-HR2复合物构象转变抑制膜融合。P-Nat因结合能更低而比P-3更有效（IC₅₀减半），且对奥密克戎变体同样有效。P-K2仅对奥密克戎变体有效，可能因其更依赖膜融合途径。研究人员建议将ACE2模拟肽与HR2模拟肽联用，可能产生协同效应并降低毒性，但需进一步验证。结论部分翻译：P-Nat、P-3和P-K2是抑制SARS-CoV-2复制（针对武汉D614G和奥密克戎BA.5.1变体）的有希望候选物。其中，P-Nat最有效，在较低浓度（12.5 μM）下即可抑制两种变体，IC₅₀低（6.26 μM），且在该浓度下无细胞毒性。同时，靶向刺突蛋白茎的P-K2对奥密克戎BA.5.1变体的抑制效果优于对武汉D614G，且无细胞毒性。ACE2模拟肽通过阻断病毒-细胞互作阻止病毒进入，而HR2模拟肽有效抑制病毒与宿主细胞的膜融合，两类肽均有助于阻止哺乳动物细胞系中的病毒复制，凸显其作为抗病毒疗法的潜力。然而，仍需进一步研究在动物感染模型中确认其效力。研究人员提出，这些肽可用作病毒感染前的预防性药物，因为它们专门设计用于阻断病毒进入宿主细胞。