N-糖基化影响轮盖小皮伞来源非特异性过氧加氧酶在酿酒酵母中的异源表达

《Microbial Biotechnology》：N-Glycosylation Influences the Heterologous Expression of an Unspecific Peroxygenase From Marasmius rotula in Saccharomyces cerevisiae

　　

N-连接糖基化可对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌的异源表达蛋白产量产生显著影响。酵母是表达非特异性过氧加氧酶（unspecific peroxygenases，UPOs）的一类常用宿主；该类酶属于过氧化物依赖型氧化还原酶（peroxide-dependent oxidoreductases）亚类，具有较高的工业生物催化应用潜力。然而，N-糖基化对重组UPO表达的影响迄今尚未得到研究。本研究考察了该类蛋白修饰对Marasmius rotula来源一类UPO在S. cerevisiae中表达的影响，该酶归属于短链过氧加氧酶蛋白亚家族。在重组rMroUPO中，研究人员通过将第43位和第151位天冬酰胺残基（N43和N151）分别替换为丝氨酸，去除了3个实际被占据的N-糖基化位点中的2个。单点替换导致分泌型rMroUPO产量下降，其中N43S影响最大，蛋白量较天然酶几乎降低4倍；N151S则表现为中等程度影响。随后，研究人员通过将相应sequon中的丝氨酸替换为苏氨酸，提高了第43位点的糖基化概率，从而提升了rMroUPO变体的表达水平。糖基化优化变体S45T的浓缩培养上清中活性UPO浓度为天然rMroUPO的2倍。结果表明，N-连接糖基化是S. cerevisiae中UPO成功异源表达的重要因素。

该论文发表于《Microbial Biotechnology》。研究聚焦于真菌非特异性过氧加氧酶（unspecific peroxygenases，UPOs）在酵母中的异源分泌表达瓶颈，核心问题是：尽管UPO兼具P450样单加氧酶与过氧化物酶样催化特性，且在羟基化、环氧化等高价值氧官能化反应中具有重要应用潜力，但不同UPO基因在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的表达表现差异显著，许多重组酶产量偏低，限制了其生物技术开发。既往工作主要从密码子优化、转录翻译调控元件和信号肽筛选等DNA/RNA或分泌起始层面进行改造，而对于分泌蛋白至关重要的N-连接糖基化（N-linked glycosylation）是否影响UPO的折叠、成熟与胞外积累，尚缺乏直接证据。鉴于UPO属于胞外糖蛋白，且酿酒酵母存在高甘露糖型超糖基化倾向，其异源表达产物的糖链结构很可能不同于天然真菌来源蛋白，因此有必要系统分析糖基化位点对重组UPO分泌产量的贡献。

为解决这一问题，研究人员选择轮盖小皮伞Marasmius rotula来源短链UPO，即MroUPO，作为模型酶开展研究。该酶天然状态下为同源二聚体，且在原始真菌宿主中可高产形成，具备良好的比较基础。研究首先结合序列分析、质谱和已有晶体结构信息，确定MroUPO中潜在及实际占据的N-糖基化位点；随后在酿酒酵母中构建特定位点去糖基化突变体与糖基化概率增强变体，比较其培养上清中的酶活、活性酶浓度、SDS-PAGE迁移行为及糖基化状态，从而判定不同N-糖基化位点对重组酶分泌表达的影响。研究最终得出清晰结论：N-糖基化确实是决定MroUPO在酿酒酵母中成功异源表达的重要因素，而且位点位置及其糖基化概率都会显著影响胞外活性酶产量。特别是靠近N端的N43位点作用最为关键；当其糖基化被削弱时，分泌产量明显下降，而通过将其对应sequon优化为更有利于糖基化的形式，则可将活性重组酶产量提高至原始水平的2倍。这一发现的重要意义在于，它将UPO表达优化策略从传统的核酸层面和信号肽工程，推进到蛋白翻译后修饰层面，为后续挖掘和表达更多潜在UPO基因、提升工业酶制剂产量提供了新的工程抓手，也对其他血红素-硫醇盐蛋白（heme-thiolate proteins）的酵母异源表达具有借鉴价值。

在技术方法方面，研究人员主要采用以下关键策略：首先利用SignalP6.0、NetNGlyc-1.0和PyMOL进行信号肽切割位点、N-糖基化sequon及其结构可及性的生物信息学分析；其次通过密码子优化基因合成、pYES2载体构建和PCR定点突变建立MroUPO及其变体表达体系，并在S. cerevisiae INVSc1中进行半乳糖诱导分泌表达；再次通过PNGase F脱糖结合质谱（mass spectrometry，MS）鉴定实际糖基化位点，通过SDS-PAGE比较分子量和聚集状态；最后以CO差谱法测定活性UPO浓度，并用藜芦醇醇氧化反应监测胞外过氧加氧酶活性。研究未涉及患者或临床样本队列。

3.1 N-Glycosylation Sites in MroUPO
本节首先界定了MroUPO中可能参与N-糖基化的位点，并比较了天然酶与重组酶的糖基化状态。研究人员对成熟MroUPO一级结构分析后发现，该蛋白包含4个符合-Asn-X-Ser/Thr-规则的经典sequon，但糖基化概率并不相同，其中N151因序列中含Thr而具有最高预测概率。结合蛋白结构模型可见，除N130位于α-螺旋起始处外，其余Asn残基多位于表面环区，具备较高可及性。为明确哪些位点在实际中被糖基化，研究人员对天然来源wtMroUPO和酿酒酵母表达的rMroUPO进行PNGase F处理后开展MS分析。结果显示，两种酶中N43与N151均出现脱酰胺导致的质量偏移，提示这两个位点确有N-聚糖连接。尽管N130对应肽段因技术原因未被MS有效覆盖，但已有晶体结构支持N130也可带糖链；N19则未获得明确证据，结合结构信息推测其并未糖基化。值得注意的是，尽管wtMroUPO与rMroUPO可能具有相同数目的N-糖基化位点，重组酶在SDS-PAGE中的表观分子量却高于天然酶约17%，提示酿酒酵母表达产物可能携带更多甘露糖残基，呈现不同糖链图谱。不过，这种糖链差异未明显改变对典型底物的酶学参数，说明其主要影响可能体现在分泌形成过程而非催化中心功能本身。

3.2 Effect of the Partial Absence of Glycosylation on the Expression of rMroUPO
本节通过去除已证实占据的糖基化位点，直接评估局部失糖基化对重组酶分泌表达的影响。研究人员选择靠近N端的N43及靠近C端的N151两个位点，将相应Asn突变为Ser，构建N43S和N151S变体。结构模型提示这些替换位于蛋白表面，理论上不应引起显著构象变化，因此更有利于将表型差异归因于糖基化丧失本身。表达实验表明，天然rMroUPO培养液在第6天具有最高胞外UPO活性，为290 U L^?1；N151S降至156 U L^?1，约降低46%；N43S仅为25 U L^?1，约为原始酶的十分之一。由于不同培养的OD₆₀₀近似，说明酵母生长与活力并未受变体表达显著影响，因此酶活差异主要来自目标蛋白分泌水平不同。浓缩上清进一步验证了这一趋势：rMroUPO、N43S和N151S的活性与活性酶浓度均依次下降，其中N43S最为显著。CO差谱测得活性酶浓度分别为11、3和8 μM，折算原始培养液中活性UPO产量约为1.9、0.5和1.4 mg L^?1。这意味着去除N43位点使分泌活性酶产量下降约3.8倍，去除N151位点则下降约1.4倍。SDS-PAGE结果进一步显示，去除单个糖基化位点后，蛋白表观分子量约下降8%，与糖链减少一致；同时其余sequon的糖基化状态未发生连带改变。由此可见，N-糖基化位点并非仅作为可有可无的表面修饰，而是直接影响rMroUPO在酿酒酵母中的成功分泌。论文讨论认为，这种影响可能与内质网（endoplasmic reticulum，ER）内的糖蛋白折叠质量控制有关：新生糖蛋白上的N-聚糖可被凝集素伴侣识别并辅助折叠，若缺失关键糖链，错误折叠蛋白更可能经内质网相关降解（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）途径清除。此外，糖链也可能对敏感结构区段起到空间保护作用，减少胞外或分泌途径中的蛋白水解降解。

3.3 Effect of an Improved Glycosylation Probability on the Expression of rMroUPO
在证实去除糖基化位点有害后，研究进一步采用相反思路，即提高关键位点的糖基化概率，以评估是否能够提升表达。研究人员聚焦于影响最显著的N43位点，将其对应sequon中的S45替换为T，构建S45T变体。由于Thr相较Ser通常更有利于寡糖转移酶（oligosaccharyltransferase，OST）识别和催化，NetNGlyc预测该突变可将N43位点糖基化概率由0.6149提升至0.6791。表达结果显示，S45T在第5天培养液中的胞外UPO活性达到356 U L^?1，明显高于天然rMroUPO的254 U L^?1，提升接近40%。各培养OD₆₀₀相似，表明这一改进并非源于生长差异。浓缩上清分析进一步证明，S45T的酶活由25.2 U mL^?1升至54.0 U mL^?1，CO差谱计算的活性酶浓度由9 μM增至18 μM，折算原始培养液中活性UPO蛋白从1.6 mg L^?1提升到3.2 mg L^?1，即总分泌活性酶量提高2倍。SDS-PAGE中，S45T与天然rMroUPO的表观分子量近乎一致，PNGase F结合MS也显示其整体糖基化位点占据状态未改变，说明产量提升并非由于新增糖链或总体糖基化程度升高，而更可能源于关键位点被糖基化的效率提高，使更多新生蛋白正确折叠、加工并分泌到胞外。该结果说明，糖基化工程不仅可以通过“保留位点”避免负面影响，还能够通过“优化sequon”主动增强分泌表达，是可操作的蛋白工程策略。

讨论部分表明，该研究将UPO异源表达中的糖基化因素从推测转变为实验支持的关键变量。天然酶与重组酶虽在催化活性上差异不大，但酿酒酵母来源rMroUPO具有更高表观分子量，反映宿主特异的糖链修饰特征；更重要的是，关键N-糖基化位点，尤其是靠近N端的N43，对活性酶分泌量具有决定性作用。研究结果支持这样一个认识：对分泌型UPO而言，糖基化在蛋白生物合成阶段所承担的折叠辅助、质量控制和稳定性保护功能，可能比其对终末催化性质的影响更为关键。论文同时指出，糖基化效应具有蛋白特异性与位点依赖性，且不仅由核心sequon决定，邻近局部序列环境也会调节糖基化效率，因此未来仍有必要进一步解析不同糖基化位点及其空间定位对UPO生物合成的精细作用机制。

研究结论部分可译为：
适当的N-连接糖基化是一个能够显著影响蛋白异源表达的过程。这一点对于酵母中胞外非特异性过氧加氧酶（UPOs）的生产显然同样成立。仍需进一步研究，以阐明糖基化及其在蛋白复合体内的定位如何以及在何种程度上实际上是重组UPO及其他血红素-硫醇盐蛋白成功生物合成的关键因素。