水溶性含氮次级代谢产物来自Talaromyces annesophieae MD2表现出抗菌、抗癌、抗氧化和细胞保护活性

《MicrobiologyOpen》：Water Soluble-Nitrogenous Secondary Metabolites From Talaromyces annesophieae MD2 Exhibit Anti-Bacterial, Anti-Cancer, Anti-Oxidant, and Cytoprotective Activities

　　

本研究聚焦于真菌Talaromyces annesophieae MD2（GenBank登录号：PQ252671）次级代谢产物的生物活性及化学表征。研究人员采用色谱技术对其培养上清液的二氯甲烷提取物（DCM-E）进行分级分离。首先从DCM-E中制备得到三个主要馏分，随后将选定的活性馏分2进一步分离为六个亚馏分。亚馏分3表现出高水溶性及对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的强效抗菌活性（对蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli和肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae的最低抑菌浓度_MIC分别为105.41、82.76、71.92和70.38 μg/mL）。该亚馏分通过调控自噬与凋亡相关途径表现出选择性抗癌活性，且不影响健康细胞（对HT-29、DU-145和SH-SY5Y细胞的半数抑制浓度_IC50分别为7.65、3.76和10.76 μg/mL）。此外，该亚馏分表现出DPPH和ABTS自由基清除活性（在100 μg/mL浓度下分别为48.3%和44.1%），并保护真皮成纤维细胞免受H₂O₂诱导的毒性。结构分析阐明，亚馏分3含有四种含氮极性化合物。其中三种化合物（C₅H₃O₄N₈、C₁₅H₂₅O₄N₄和C₂₃H₂₁N₄）被推测为生物碱样或富氮杂环次级代谢产物，而剩余化合物（C₉H₉O₄N）可能为氨基苯甲酸型或杂芳族羧酸衍生物。这是首次关于T. annesophieae生物活性代谢产物的报道。由于其多功能生物活性，该代谢产物可应用于皮肤化妆品和药理学领域。

**论文解读：Talaromyces annesophieae MD2水溶性含氮次级代谢产物的多效生物活性研究**

**研究背景与问题**
微生物次级代谢产物是药物和化妆品活性成分的重要来源。真菌，特别是丝状真菌如曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和Talaromyces属，已被证实能产生结构多样的生物活性分子，包括生物碱、苯并吡喃酮、醌类、肽类、酚类、类黄酮、萜类等。Talaromyces属包含171个物种，广泛分布于土壤、植物、海绵和食品中，其代谢产物具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗炎等多种活性，在制药、医疗和生物技术领域具有潜力。然而，尽管已有研究报道了T. flavus、T. pinophilus等物种的活性代谢产物，但关于Talaromyces annesophieae这一相对新近鉴定的物种，其生物活性代谢产物的研究尚属空白。因此，研究人员旨在系统探索从土耳其埃尔祖鲁姆省土壤中分离的T. annesophieae MD2菌株的次级代谢产物，评估其抗菌、抗癌、抗氧化和细胞保护活性，并进行化学表征，以填补该菌种生物活性研究的缺失。

**研究内容与结论**
研究人员从土壤样品中分离出40株真菌，通过初步抗菌筛选，选择对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制活性的菌株MD2，经18S rRNA基因测序和系统发育分析鉴定为Talaromyces annesophieae（GenBank登录号PQ252671）。随后，对培养上清液进行二氯甲烷（DCM）提取，并通过Sephadex LH-20凝胶色谱和C18反相柱色谱进行生物活性导向分级，最终获得六个亚馏分，其中亚馏分3（Sub-fr. 3）表现出最强的抗菌活性，并被选作后续研究目标。亚馏分3对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌S. aureus、蜡样芽孢杆菌B. cereus）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌E. coli、肺炎克雷伯菌K. pneumoniae）均具有抑制作用，MIC值分别为82.76、105.41、71.92和70.38 μg/mL。在抗癌活性方面，亚馏分3对HT-29（人结直肠腺癌细胞）、DU-145（人前列腺癌细胞）和SH-SY5Y（人神经母细胞瘤细胞）表现出选择性细胞毒性，IC₅₀值分别为7.65、3.76和10.76 μg/mL，而对健康肺成纤维细胞MRC-5无显著影响。机制研究表明，亚馏分3通过上调凋亡相关基因（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax）和自噬相关基因（Beclin-1、Atg14）的表达，同时激活炎症信号通路（Caspase-1、NF-κB），从而诱导癌细胞死亡。在抗氧化方面，亚馏分3在100 μg/mL浓度下对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为48.3%和44.1%，呈浓度依赖性。此外，亚馏分3能显著保护正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）免受H₂O₂诱导的氧化毒性，在80 μg/mL浓度下细胞存活率显著高于H₂O₂单独处理组。化学表征（UV、HPLC、GC-MS、LC-MS/MS）显示，亚馏分3含有四种含氮极性化合物：C₅H₃O₄N₈（正离子模式主导，推测为富氮杂环代谢物）、C₉H₉O₄N（负离子模式主导，可能为氨基苯甲酸型或杂芳族羧酸衍生物）、C₁₅H₂₅O₄N₄和C₂₃H₂₁N₄（后两者推测为生物碱样或富氮杂环代谢物）。该研究首次报道了T. annesophieae的生物活性代谢产物，其多功能活性表明该菌株的次级代谢产物在抗菌治疗、抗癌药物和皮肤化妆品开发中具有潜在应用价值。

**主要技术方法**
研究采用的关键技术方法包括：从土耳其Erzurum四个地点（Pasinler、Tortum、Yakutiye、Paland?ken）的松林土壤样品中分离丝状真菌；基于ITS rRNA基因测序进行分子鉴定；二氯甲烷提取和乙酸乙酯提取比较；Sephadex LH-20凝胶色谱和C18反相柱色谱进行生物活性导向分级；琼脂扩散法和微量稀释法测定抗菌活性（MIC）；WST-1法评估抗癌细胞毒性；定量实时PCR（qRT-PCR）分析凋亡和自噬相关基因表达；DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性；H₂O₂诱导的NHDF毒性模型评估细胞保护作用；UV光谱、HPLC、GC-MS和LC-MS/MS进行化学表征。

**研究结果总结**
- **3.1 抗菌代谢产物产生菌的分离与鉴定**：从40株真菌中筛选出对E. coli和S. aureus均具活性的菌株MD2，经18S rRNA基因序列分析鉴定为Talaromyces annesophieae，这为后续研究奠定了基础。
- **3.2 培养上清液不同提取物的抗菌活性**：DCM提取物对E. coli和S. aureus的抑菌圈直径（20 mm和17 mm）显著大于乙酸乙酯提取物（12 mm和10 mm），因此后续研究采用DCM提取物。
- **3.3 DCM提取物的分级分离**：通过色谱分离获得三个主要馏分，其中馏分2对两种细菌均具活性；进一步分离得到六个亚馏分，仅亚馏分3（水溶性）在100 μg/mL浓度下对E. coli和S. aureus显示抑菌活性（抑菌圈直径分别为20 mm和13 mm），被选为活性组分。
- **3.4 亚馏分3的生物活性**
- **3.4.1 抗菌活性**：亚馏分3在150 μg/mL浓度下对S. aureus、B. cereus、E. coli和K. pneumoniae的抑菌圈直径分别为21、19、23和22 mm；MIC值分别为82.76、105.41、71.92和70.38 μg/mL，显示广谱抗菌作用。
- **3.4.2 抗癌活性**：亚馏分3对HT-29、DU-145和SH-SY5Y细胞具有选择性细胞毒性（IC₅₀分别为7.65、3.76和10.76 μg/mL），而对MRC-5健康细胞无影响。基因表达分析显示，20 μg/mL亚馏分3处理24 h后，三种癌细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Beclin-1、Atg14、Caspase-1和NF-κB的表达均显著上调，表明其通过激活外源性和内源性凋亡途径、自噬及炎症信号发挥抗癌作用。
- **3.4.3 抗氧化活性**：亚馏分3在100 μg/mL浓度下对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为48.3%和44.1%，活性呈浓度依赖性，但弱于维生素C。
- **3.4.4 体外细胞保护作用**：在H₂O₂诱导的NHDF毒性模型中，亚馏分3预处理（10-80 μg/mL）可减轻氧化损伤，80 μg/mL浓度下细胞存活率显著高于H₂O₂单独处理组，提示其具有皮肤保护潜力。
- **3.5 亚馏分3的化学表征**：UV光谱显示λmax在230-240 nm，提示芳香性；HPLC在235 nm处检测到至少四个极性相近的化合物；LC-MS/MS鉴定出四个主要含氮化合物：C₅H₃O₄N₈（正离子模式主导，富氮杂环代谢物）、C₉H₉O₄N（负离子模式主导，氨基苯甲酸型或杂芳族羧酸衍生物）、C₁₅H₂₅O₄N₄和C₂₃H₂₁N₄（生物碱样或富氮杂环代谢物）；所有化合物均未在GC-MS中检测到，表明其极性、非挥发性和热不稳定性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，亚馏分3的抗菌活性可能与含氮杂环化合物（如C₉H₉O₄N）的氨基苯甲酸型结构有关，此类结构已知具有抗菌作用。抗癌机制方面，同时上调凋亡和自噬基因表明亚馏分3可能通过促进细胞死亡而非保护性自噬发挥作用，NF-κB的升高可能反映应激反应。与文献中其他Talaromyces物种的代谢产物相比，亚馏分3的IC₅₀值更低，显示更强的抗癌潜力。抗氧化活性虽中等，但结合细胞保护作用，提示其可用于对抗氧化应激相关皮肤损伤。结构-活性关系分析认为，高氮含量和杂环平面结构有利于与DNA和蛋白质的相互作用。结论部分总结：本研究首次报道了T. annesophieae MD2的次级代谢产物，亚馏分3含有四种含氮极性代谢物，具有广谱抗菌、选择性抗癌、抗氧化和细胞保护活性，在抗菌治疗、肿瘤学和皮肤化妆品领域具有应用前景。但需进一步纯化单个化合物并阐明其作用机制。该论文发表在《MicrobiologyOpen》。