《Molecular Carcinogenesis》：The CRABP2–MDK Signaling Axis Promotes Lung Adenocarcinoma (LUAD) Progression and Highlights Prognostic Biomarkers
编辑推荐：
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中LUAD以高发病率和死亡率著称。尽管采用了包括手术、化疗、免疫治疗和分子靶向治疗在内的多种治疗手段，LUAD患者的预后仍然不佳。因此，LUAD的诊断和治疗仍面临重大挑战，迫切需要识别新的治疗靶点。在本研究中，研究人员分析了
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中LUAD以高发病率和死亡率著称。尽管采用了包括手术、化疗、免疫治疗和分子靶向治疗在内的多种治疗手段，LUAD患者的预后仍然不佳。因此，LUAD的诊断和治疗仍面临重大挑战，迫切需要识别新的治疗靶点。在本研究中，研究人员分析了单细胞转录组数据（GSE253013数据集），以探究LUAD中上皮细胞的异质性。研究人员鉴定了肿瘤特异性上皮细胞亚群，并评估了这些亚群的特征基因在多个GEO数据集中的预后和诊断潜力。通过功能实验验证了CRABP2在肺癌细胞中的作用。进一步进行了异种移植小鼠模型、回复实验以及涉及ATRA–RAR信号通路的机制分析，以阐明其分子机制。CRABP2表达与LUAD中的MDK呈正相关。功能实验表明，CRABP2通过激活MDK/VEGF/MMP2/9/AKT信号轴促进细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成拟态。体内异种移植实验进一步证实，敲低CRABP2可抑制肿瘤生长和血管生成。回复实验将MDK确定为CRABP2的关键下游效应分子。机制上，CRABP2通过激活ATRA–RAR信号通路增强MDK转录，并增加RARA在MDK启动子上的占有率。临床上，CRABP2高表达与不良预后相关，并在LUAD中表现出强大的诊断性能。总之，研究人员的发现确定了驱动LUAD进展和血管生成的CRABP2–ATRA–RAR–MDK信号轴。CRABP2通过激活RAR信号促进MDK转录，从而增强恶性表型和血管生成拟态。这些结果确立了CRABP2作为有前景的诊断和预后生物标志物，并提示靶向CRABP2–MDK轴可能成为LUAD的潜在治疗策略。
**研究背景与问题**
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的亚型，具有高发病率和死亡率。尽管手术、化疗、免疫治疗和分子靶向治疗等策略不断进步，但LUAD患者5年生存率仍仅约15%，预后不良。肿瘤异质性是治疗管理的主要挑战。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为解析肿瘤微环境（TME）的细胞异质性和细胞间相互作用提供了新手段。然而，LUAD中肿瘤特异性上皮细胞亚群及其驱动恶性进展的分子机制尚不完全清楚，迫切需要识别新的治疗靶点和生物标志物。
**研究内容与结论**
研究人员利用单细胞转录组数据集（GSE253013，包含9例LUAD原发肿瘤样本）和多个独立GEO队列（GSE140797、GSE43458、GSE32665、GSE31210）及TCGA-LUAD队列（共1064例样本），系统分析了LUAD的细胞异质性和关键分子。通过功能实验（细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成拟态（VM））、异种移植裸鼠模型、回复实验及机制研究，揭示了CRABP2–MDK信号轴的作用。结论：CRABP2通过激活ATRA–RAR信号通路促进MDK转录，进而激活下游VEGF/MMP2/MMP9/AKT信号，驱动LUAD恶性表型和血管生成；CRABP2是独立的预后生物标志物，靶向该轴可能成为LUAD潜在治疗策略。论文发表在《Molecular Carcinogenesis》。
**主要关键技术方法**
1. **单细胞转录组分析**：使用Seurat进行数据降维、聚类和细胞注释；Harmony整合批次效应；UMAP可视化。
2. **分化状态预测**：CytoTRACE算法评估细胞干性。
3. **转录因子（TF）分析**：SCENIC（pySCENIC）构建调控子并计算活性。
4. **细胞通讯分析**：CellChat（v2.1.2）分析配体-受体互作。
5. **拷贝数变异（CNV）评估**：inferCNV比较上皮细胞与内皮细胞参考。
6. **体外功能实验**：CCK-8（增殖）、Transwell（侵袭）、划痕愈合（迁移）、三维Matrigel培养（VM）。
7. **体内实验**：BALB/c裸鼠皮下异种移植模型（H1975细胞）。
8. **分子机制验证**：Western blot、qRT-PCR、ChIP-qPCR（检测RARA在MDK启动子上的结合）。
样本队列来源：GSE253013（9例LUAD scRNA-seq）、TCGA-LUAD（500例）、GSE140797（14例）、GSE43458（110例）、GSE32665（179例）、GSE31210（246例）。
**研究结果**
**3.1 单细胞转录组图谱揭示LUAD肿瘤和癌旁组织中细胞比例异常**
通过UMAP聚类，共鉴定出9种细胞类型（T/NK细胞、髓系细胞、B细胞、上皮细胞、成纤维细胞、浆细胞、内皮细胞、肥大细胞、纤毛细胞）。肿瘤组织中上皮细胞比例显著降低，B细胞比例升高。CytoTRACE显示上皮细胞分化程度低、干性高；肿瘤组织中成纤维细胞分化程度也低于癌旁组织。通路分析发现肿瘤中内皮细胞和成纤维细胞的上皮-间充质转化（EMT）通路显著上调，上皮细胞中干扰素α/γ信号及炎症通路激活。
**3.2 上皮细胞亚群功能特征与拷贝数变异**
上皮细胞进一步分为7个亚群：AT2、Cancer（CRABP2+）、AT1、Clara细胞、Cancer（TM4SF1+）、Cancer（UBE2C+）、Basal细胞。其中Cancer（CRABP2+）、Cancer（TM4SF1+）和Cancer（UBE2C+）三个亚群仅在肿瘤组织中出现。功能富集分析显示Cancer（CRABP2+）亚群与抗原加工呈递通路相关。inferCNV分析表明，这三个肿瘤特异性亚群拷贝数变异（CNV）水平显著高于内皮细胞，确认其恶性身份。
**3.3 上皮细胞转录因子活性分析**
SCENIC分析显示，HOXB5调控子在Cancer（CRABP2+）亚群中高度激活，KLF3调控子在Cancer（TM4SF1+）亚群中高度激活。CRABP2被预测为HOXB5的下游效应基因，C15orf48被预测为KLF3的下游效应基因。CRABP2在Cancer（CRABP2+）亚群中特异性高表达，C15orf48在Cancer（TM4SF1+）亚群中特异性高表达，提示两者可能作为LUAD的生物标志物。
**3.4 CRABP2和C15orf48的验证与预后意义**
在GSE140797、GSE43458、GSE32665、GSE31210数据集中，CRABP2和C15orf48在LUAD肿瘤组织中均高表达，且与肿瘤分期无显著关联。Kaplan-Meier生存分析显示，两者高表达均与总生存期（OS）较差显著相关。ROC曲线分析显示，CRABP2区分LUAD与正常肺组织的AUC为0.90，C15orf48为0.85。多变量Cox回归分析表明，仅CRABP2是独立预后因素（HR=1.30，p=0.027），而C15orf48无独立预后意义。因此，后续实验选择CRABP2进行功能验证。
**3.5 CRABP2和C15orf48在LUAD组织中表达上调**
qRT-PCR和免疫组化（IHC）证实，与癌旁组织相比，LUAD组织中CRABP2和C15orf48的mRNA和蛋白水平均显著升高（n=20，p<0.0001）。
**3.6 CellChat分析揭示细胞间通讯网络**
与癌旁组织相比，肿瘤组织中细胞间相互作用数量和强度增强，尤其是成纤维细胞与内皮细胞之间的通讯。上皮细胞作为信号发送者，与其它细胞类型相互作用增强；髓系细胞接收最强信号，成纤维细胞发送最强信号。COLLAGEN、MK、APP、MHC-II等通路信息流在肿瘤组织中显著增加，特别是成纤维细胞通过COLLAGEN和MK通路与上皮细胞通讯，其中MDK-SDC1配体-受体对增加。
**3.7 CRABP2相关的细胞通讯变化**
将肿瘤样本按CRABP2表达高低分组，CellChat分析显示，CRABP2高表达组中上皮细胞-上皮细胞间通讯增强，涉及MDK-SDC4、MDK-SDC1、CEACAM6-CEACAM6等信号；成纤维细胞-T/NK细胞间通讯增强，涉及COL6A2-CD44、COL1A1-CD44等信号。信息流分析显示，VEGF、CD99、MDK、ICAM、CEACAM通路在CRABP2高表达组中显著增强，提示更强的血管生成、粘附和细胞通讯活性。
**3.8 CRABP2与MDK在LUAD中的表达和相关性**
MDK在LUAD患者中显著高表达，且高表达与较差OS相关。CRABP2与MDK表达呈正相关。在5株肺癌细胞系（A549、H1975、H23、H69、PC-9）中，H1975和H23细胞形成VM结构能力最强，且CRABP2和MDK蛋白表达水平最高。CRABP2敲低（sh#1、sh#2）显著降低CRABP2蛋白表达。
**3.9 CRABP2促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭**
在H1975和H23细胞中，CRABP2敲低后，VM结构数量显著减少，细胞侵袭能力（Transwell）、增殖能力（CCK-8）和迁移能力（划痕愈合）均显著抑制。
**3.10 CRABP2通过MDK及其下游信号通路介导肺癌细胞功能**
CRABP2敲低导致MDK、MMP2、MMP9、VEGF和p-AKT（Ser473）蛋白水平下降，表明CRABP2通过调控MDK及其下游VEGF、MMPs和AKT信号促进恶性表型。
**3.11 CRABP2敲低在体内抑制肿瘤生长和血管生成**
异种移植小鼠模型中，shCRABP2组肿瘤体积和生长速率显著低于shCtrl组。IHC显示CRABP2、MDK、Ki-67、VEGF-A表达降低，CD31染色显示微血管密度（MVD）降低。Western blot证实CRABP2敲低后MDK、VEGF、p-AKT水平下降。
**3.12 CRABP2过表达促进肺癌细胞侵袭、迁移和血管生成拟态**
CRABP2过表达后，H23和H1975细胞的侵袭、迁移能力以及VM形成能力显著增强。
**3.13 MDK是CRABP2的关键下游效应分子**
回复实验显示，CRABP2敲低后H23和H1975细胞的侵袭和VM形成能力受损，而MDK过表达可部分恢复这些表型，证实MDK是CRABP2的关键下游效应分子。
**3.14 CRABP2通过ATRA–RAR信号轴调控MDK转录**
JASPAR分析发现MDK启动子区域存在RARA结合基序。TCGA-LUAD队列中RARA与MDK表达呈正相关。CRABP2过表达联合ATRA处理可增强MDK蛋白和mRNA表达，而RAR拮抗剂AGN193109可逆转此效应。ChIP-qPCR实验表明，CRABP2敲低后RARA在MDK启动子上的富集显著减少，证实CRABP2通过激活ATRA–RAR信号促进MDK转录。
**讨论与结论**
**讨论总结**：研究通过单细胞转录组分析揭示LUAD中上皮细胞比例降低、EMT通路激活及肿瘤特异性上皮亚群（Cancer（CRABP2+）等）的存在。CRABP2作为独立预后生物标志物，通过ATRA–RAR信号轴促进MDK转录，进而激活VEGF/MMP2/MMP9/AKT信号，驱动VM形成、增殖、迁移和侵袭，并在体内促进肿瘤生长和血管生成。C15orf48虽具诊断潜力但非独立预后因素。靶向CRABP2–MDK轴可能为LUAD提供新治疗策略。
**结论翻译**：研究人员的发现鉴定了一个先前未被认识的CRABP2–ATRA–RAR–MDK信号轴，该轴驱动LUAD进展和血管生成。通过促进MDK转录及下游VEGF/MMP2/MMP9/AKT信号，CRABP2在体外增强恶性表型，在体内促进肿瘤生长。这些结果确立了CRABP2作为有前景的诊断和预后生物标志物，并成为LUAD的潜在治疗靶点。
