Puccinia triticina 效应蛋白 Pt3863 靶向并劫持 TaRLCK176 以抑制小麦对叶锈病的抗性

《Molecular Plant Pathology》：Puccinia triticina Effector Pt3863 Targets and Subverts TaRLCK176 to Suppress Wheat Resistance to Leaf Rust

　　

由 Puccinia triticina 引起的小麦叶锈病是一种广泛发生且具有重大经济重要性的小麦病害。在侵染过程中，P. triticina 分泌效应蛋白(effectors)以操纵寄主免疫。研究人员在此鉴定并表征了 P. triticina 效应蛋白 Pt3863，其在侵染早期高表达并显著增强真菌毒力。研究人员还鉴定了小麦受体样胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinase, TaRLCK176)作为 Pt3863 的靶标。功能测定表明，TaRLCK176 正向调节小麦对叶锈病的抗性，并且是几丁质(chitin)诱导的活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累所必需的。Pt3863 通过双重抑制机制颠覆这一防御：首先，其抑制 TaRLCK176 磷酸化；其次，其通过泛素-26S 蛋白酶体(ubiquitin-26S proteasome)途径促进 TaRLCK176 降解。宿主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing, HIGS) Pt3863 削弱了 P. triticina 毒力，而在转基因小麦系中过表达该基因则增加了对 P. triticina 的感病性。相反，病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS) TaRLCK176 损害了小麦抗性。研究人员的发现确立了 TaRLCK176 作为一个关键的免疫枢纽，正向调节小麦对叶锈病的抗性，并被 P. triticina 效应蛋白 Pt3863 特异性靶向。值得注意的是，Pt3863 进化出了一种复杂的毒力策略，同时破坏 TaRLCK176 的磷酸化介导的激活和蛋白酶体稳定性，从而损害寄主免疫反应。本研究阐明了 P. triticina 抑制小麦免疫的关键分子机制，并强调 TaRLCK176 作为小麦抗叶锈病持久抗性遗传工程的理想候选靶标。

该研究发表于《Molecular Plant Pathology》，围绕专性活体营养真菌 Puccinia triticina 引起的小麦叶锈病展开。植物通过细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen-/microbe-associated molecular patterns, PAMPs/MAMPs)激活模式触发免疫(pattern-triggered immunity, PTI)，包括钙离子内流、活性氧(reactive oxygen species, ROS)爆发及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联激活等；而病原菌则分泌效应蛋白(effectors)抑制 PTI 以促进感病。受体样胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinases, RLCKs)是 PTI 信号转导的关键节点，其中 RLCK-VII 亚家族成员（如拟南芥 BIK1、水稻 OsRLCK176）常被多种病原效应蛋白靶向，但小麦中该通路在叶锈菌互作中的宿主靶标及效应蛋白操控机制尚不清楚。鉴于 TaRLCK176 作为 BIK1 直系同源物在小麦抗条锈病中被证实为效应蛋白靶标，研究人员假设叶锈菌可能通过类似策略靶向 TaRLCK176，因而开展本研究以鉴定叶锈菌效应蛋白 Pt3863 的功能、其宿主靶标及免疫抑制分子机制。

研究人员从毒性叶锈菌小种转录组数据库中鉴定候选效应蛋白 Pt3863，通过结构表达分析、分泌功能验证、亚细胞定位明确其基本特征；利用宿主诱导基因沉默(host-induced gene silencing, HIGS)与转基因过表达解析 Pt3863 在真菌毒力与小麦抗性中的功能；借助免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)、分裂荧光素酶互补验证 Pt3863 与 TaRLCK176 的互作；通过环己酰亚胺(cycloheximide, CHX)追踪、蛋白酶体抑制剂 MG132 处理及 Phos-tag 凝胶电泳，阐明 Pt3863 对 TaRLCK176 蛋白稳定性与磷酸化的影响；并利用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)明确 TaRLCK176 在小麦抗叶锈病中的免疫调节作用。样本来源于易感小麦品种 Thatcher 接种毒性叶锈菌小种 KHHT、JHKT 和 THSN 的转录组数据库，以及小麦栽培品种 Fielder 接种叶锈菌小种 THTT 的实验材料，部分瞬时表达与互作验证在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中进行。

2 Results

2.1 Structural and Expression Analysis of Pt3863

研究人员对 Pt3863 进行序列与表达分析，发现其编码 120 个氨基酸的分泌蛋白，含 N 端 1–19 位氨基酸信号肽(signal peptide, SP)，无跨膜域与已知 Pfam 基序，为 13.01 kDa 小分子蛋白，等电点(pI) 8.8，感染早期转录水平上调并在接种后 24 h 达峰值，提示其在 P. triticina 致病性中的潜在作用。

2.2 N-Terminal SP of Pt3863 Has a Secretory Function

研究人员利用酵母信号序列陷阱 assay 验证 Pt3863 预测 SP 的分泌功能，将 Pt3863SP 融合至 pSUC2 载体转化缺陷型菌株 YTK12，结果显示 Pt3863SP 能成功引导转化酶分泌并在含蔗糖培养基上生长，证实其具分泌功能。

2.3 Pt3863 Is Localized in the Plasma Membrane and Nucleus

研究人员通过在本氏烟草叶片瞬时共表达 Pt3863-GFP 与膜标记 StSOBIR1-mCherry、核标记 POP2-mCherry，经激光共聚焦显微镜观察，发现 Pt3863 呈细胞膜与细胞核双重定位；质壁分离试验显示部分荧光位于胞外，提示 Pt3863 进入细胞后定位于膜与核，为其与膜定位 TaRLCK176 互作提供空间依据。

2.4 Silencing of Pt3863 Compromises P. triticina Virulence

研究人员利用大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus, BSMV)介导的 HIGS 在小麦中沉默 Pt3863，发现 Pt3863 表达量下降，叶锈菌毒力减弱，夏孢子量减少、侵染面积减小，宿主 ROS 积累增强，抗病相关基因 TaPR1、TaWRKY74、TaWRKY41、TaPR2 上调；在本氏烟草中瞬时表达 Pt3863 抑制 flg22 与几丁质诱导的 ROS 积累及 MAPK 激活，证明 Pt3863 是关键毒力因子，通过抑制 PTI 促进侵染。

2.5 Overexpression of Pt3863 Attenuates the Wheat Resistance to P. triticina

研究人员获得稳定过表达 Pt3863^ΔSP-FLAG 的转基因 Fielder 小麦系，发现转基因株系植株生长无异常，但对 THTT 小种感病性增加，夏孢子产量与侵染面积显著上升；接种后 ROS 积累减少，几丁质触发的 H₂O₂ 与 O₂^? 爆发受抑，TaPR1、TaPR2、TaWRKY41、TaWRKY74 表达下调，表明 Pt3863 过表达抑制小麦对叶锈菌的免疫反应并促进感病。

2.6 Pt3863 Interacts With TaRLCK176

研究人员通过 Co-IP 与分裂荧光素酶互补 assay 在体内验证 Pt3863 与小麦 AtBIK1 直系同源蛋白 TaRLCK176 物理互作；共表达时 TaRLCK176 蛋白积累量显著降低，提示 Pt3863 可能影响 TaRLCK176 蛋白稳定性，确立 TaRLCK176 为 Pt3863 的宿主靶标。

2.7 TaRLCK176 Participates in Wheat Defence Responses Against P. triticina

研究人员在本氏烟草中沉默 NbBIK1 抑制 flg22 与几丁质诱导 ROS，瞬时表达 TaRLCK176 可恢复并提升 ROS 积累，表明 TaRLCK176 功能同源 BIK1 调控 PTI 相关 ROS。在小麦中用 BSMV:VIGS 沉默 TaRLCK176，导致对叶锈病抗性下降、夏孢子增多、ROS 减少、抗病基因下调；Pt3863^ΔSP-OE 株系中 TaRLCK176 早期表达降低，证明 TaRLCK176 参与小麦抗叶锈免疫应答。

2.8 Pt3863 Affects TaRLCK176 Stability and Phosphorylation

研究人员在共表达 Pt3863-HA 与 TaRLCK176-FLAG 的本氏烟草中用 CHX 终止蛋白合成，发现 TaRLCK176 蛋白水平逐渐低于对照；荧光素酶融合 TaRLCK176-LUC 信号在 Pt3863 存在时显著下降，证明 Pt3863 促 TaRLCK176 降解。用 26S 蛋白酶体抑制剂 MG132 处理可恢复 TaRLCK176 蛋白丰度，表明降解依赖泛素-26S 蛋白酶体途径。在 MG132 预处理消除降解干扰后，几丁质诱导的 TaRLCK176 磷酸化带移在 Pt3863 共表达时被抑制，说明 Pt3863 同时抑制 TaRLCK176 自磷酸化与几丁质诱导磷酸化，即通过破坏磷酸化激活与蛋白酶体稳定性双重机制颠覆防御。

讨论部分指出，研究人员通过多证据链证实 Pt3863 是关键致病因子：沉默削弱毒力、增强 ROS 与抗病基因表达，过表达增加感病性、抑制 ROS 与抗病基因；Pt3863 在本氏烟草广谱抑制 flg22 与几丁质诱导的 PTI 响应。植物免疫依赖 RLCK 转导 PTI 信号，TaRLCK 功能在小麦保守，沉默 TaRLCK176 抑制几丁质触发 ROS，证明其为核心 PTI 组分。病原效应蛋白常靶向 RLCK 操控免疫，本研究发现 Pt3863 与 TaRLCK176 互作并降低其积累，与近期条锈菌效应蛋白 Pst08755 靶向同一宿主激酶但序列相似性仅约 12% 的现象共同表明 TaRLCK176 是小麦–锈病互作的“共同战场”，不同锈菌独立进化出效应蛋白破坏该激酶。Pt3863 通过泛素介导 26S 蛋白酶体途径促进 TaRLCK176 降解，与拟南芥 BIK1 受 PUB25/26 与 PUB4 调控类似，揭示跨物种保守免疫抑制策略；此外 Pt3863 额外抑制 TaRLCK176 磷酸化，较单一降解机制更复杂。Pt3863 膜与核双重定位提示其可能存在额外核内功能，但具体机制待究；介导降解的精确 E3 连接酶尚未明确。综上，P. triticina 效应蛋白 Pt3863 通过同时损害中心免疫激酶 TaRLCK176 的磷酸化与稳定性来抑制免疫，研究推进了对小麦–叶锈菌互作的分子理解，并将 TaRLCK176 确立为工程化持久抗性的潜力靶标。

结论部分翻译如下：

总之，本研究阐明了 P. triticina 通过其效应蛋白 Pt3863 所采用的一种复杂毒力策略，该策略同时损害中心免疫激酶 TaRLCK176 的磷酸化与稳定性。研究人员的发现不仅推进了对小麦–P. triticina 互作的分子理解，还强调 TaRLCK176 作为工程化抗性的一项有前景的靶标。

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