综述：疟原虫中差异性的自噬通路：机制、功能和治疗潜力

《Molecular Microbiology》：Divergent Autophagy Pathways in Plasmodium: Mechanisms, Functions, and Therapeutic Potential

　　

自噬是一种高度保守的降解和循环途径，对于维持细胞稳态至关重要。尽管其分子机制在酵母和哺乳动物系统中已得到充分表征，但在早期分化的顶复门寄生虫疟原虫（Plasmodium）中研究较少，该寄生虫是疟疾的病原体。疟原虫拥有一个精简但功能齐全的自噬相关（ATG）蛋白库，表明该途径适应了寄生虫特异性生物学。其中，ATG8是一种泛素样蛋白，已成为疟原虫自噬的核心标志物和关键效应因子。其分支定位与残留质体（apicoplast）膜的关联表明，其功能超出了经典降解性自噬，特别是在细胞器维持和生物发生中。ATG7是一种必需的E1样酶，可激活ATG8并促进其脂化，从而调节细胞器更新和发育。该过程进一步由保守的结合系统支持，涉及ATG3（E2样酶）和ATG12、ATG5、ATG16复合物，该复合物作为连接酶使ATG8与膜结合。ATG4是一种半胱氨酸蛋白酶，对于回收脂化形式的ATG8并维持其胞质池至关重要，而同源蛋白Otu可以部分补偿其功能。ATG18也在顶质体生物发生和维持中发挥重要作用。总之，这些发现强调了自噬蛋白在疟原虫中的经典和非经典作用，驱动代谢重编程、细胞内重塑和阶段特异性分化，并支持它们作为新型抗疟疗法靶点的潜力。

**1 引言**
顶复门（Apicomplexa）包含超过5000种专性细胞内寄生虫，具有重要的医学和经济重要性。该门成员引起人类和动物的多种疾病。其中，引起疟疾的疟原虫（Plasmodium）物种仍然是全球主要的健康负担，导致全球范围内显著的发病和死亡。顶复门寄生虫的一个决定性特征是存在称为顶复合体的特化入侵装置，该装置由分泌细胞器如棒状体（rhoptries）、微线体（micronemes）、致密颗粒（dense granules）和极环（polar rings）组成。这些结构对于宿主细胞附着、入侵和建立细胞内感染至关重要。大多数顶复门寄生虫拥有一个称为顶质体（apicoplast）的残留质体，源自二次内共生。顶质体对于寄生虫生存不可或缺，承载着关键代谢途径，包括类异戊二烯前体合成和脂肪酸生物合成。疟原虫的复杂生命周期涉及蚊子和哺乳动物宿主之间的转换，需要广泛细胞重塑、细胞器生物发生和代谢重编程。在这些动态条件下维持细胞稳态对于寄生虫生存和分化至关重要，积累的证据表明自噬相关过程在这些适应中发挥重要作用。
自噬是一种高度保守的真核过程，介导细胞质成分的降解和回收，以维持细胞稳态。在酵母和哺乳动物等模型系统中，自噬通常在营养胁迫下被诱导，涉及形成双层膜的自噬体（autophagosome），该自噬体隔离细胞质物质，随后与溶酶体融合进行降解。该过程有助于多种细胞功能，包括营养回收、细胞器更新、细胞分化和抵御细胞内病原体。相比之下，疟原虫中的自噬机制似乎高度分化且仅部分保守。基因组分析表明，酵母中鉴定出的经典ATG蛋白中约有三分之一存在于疟原虫中。事实上，这种寄生虫缺乏常规溶酶体，而是使用一种溶酶体样细胞器，即食物泡（food vacuole），尽管额外降解区室的存在仍不清楚。这些差异表明疟原虫中的自噬可能通过非经典机制运作。
与酵母和哺乳动物不同，疟原虫仅拥有有限子集的经典自噬相关蛋白。全基因组分析显示，酵母中鉴定出的45个自噬相关同源物中，只有14个在疟原虫中保守。在保守组分中，ATG8已成为疟原虫中的关键标志物和功能蛋白。与常规系统不同，在常规系统中ATG8是胞质蛋白，并在自噬诱导时被招募到膜上，而伯氏疟原虫（P. berghei）的ATG8是组成型表达，并在整个寄生虫生命周期中主要与膜相关。这种不寻常的行为，加上缺乏多个上游调控组分，突显了该生物体中自噬调控和功能的根本差异。除了其在分解代谢中的经典作用外，伯氏疟原虫中的自噬还涉及几个非常规过程，包括顶质体生物发生，特别是在肝期发育期间，以及分泌细胞器（如TRAP相关微线体）的清除。有趣的是，使用3-甲基腺嘌呤或氯喹等化合物对经典自噬途径进行药理学抑制，并未显著改变ATG8的定位或表达，进一步支持了存在独特调控框架的观点。
虽然对模型真核生物的研究提供了对自噬的基础理解，但来自顶复门寄生虫的新证据揭示了与经典途径的显著偏差。在诸如疟原虫等专性细胞内寄生虫中，它们驻留在富含营养的环境（如红细胞）中，自噬似乎超越了简单的饥饿反应，反而有助于寄生虫发育、分化和细胞器维持。
在本综述中，研究人员总结了目前关于疟原虫中自噬相关蛋白的知识，并讨论了它们在寄生虫生物学中的非常规作用。研究人员重点介绍了揭示自噬机制寄生虫特异性适应的近期进展，并探讨了它们作为新型抗疟策略靶点的潜力。

**2 疟原虫中的ATG8结合系统及相关蛋白**
疟原虫中的自噬不同于经典真核途径。虽然经典自噬主要介导营养回收和胁迫适应，但在疟原虫中，ATG蛋白被重新利用以支持细胞器生物发生、细胞重塑和阶段特异性发育。这种差异反映了寄生虫自噬组分库的减少及其对脊椎动物和蚊子宿主内复杂生命周期转换的适应。在疟原虫中，一个保守的核心ATG蛋白子集——ATG3、ATG4、ATG5、ATG7、ATG12，以及可能的ATG16——参与ATG8脂化系统，该系统是膜动力学的核心。ATG8是一种泛素样蛋白，通过一个涉及E1样酶ATG7、E2样酶ATG3和以E3样方式发挥作用的ATG12-ATG5复合物的泛素样途径，与磷脂酰乙醇胺（PE）结合。这种脂化将ATG8锚定在膜上，促进吞噬泡（phagophore）的形成和扩展。疟原虫中ATG8阳性结构常与顶质体（apicoplast）相关，顶质体是一种对寄生虫生存必不可少的非光合质体，这突显了其在细胞器维持而非大量胞质降解中的特化作用。疟原虫ATG8的一个显著特征是在暴露的C端甘氨酸，这绕过了ATG4介导的引物切割需求。相反，ATG4主要作用于ATG8从膜上的去结合，表明脂化循环的调控机制发生了改变。尽管ATG12-ATG5-ATG16复合物在疟原虫中研究较少，但现有证据表明它有助于ATG8结合和膜重塑，类似于其在其他真核生物中的作用。推定的ATG5作为连接酶复合物的一部分，在所有红细胞内期组成型表达；此外，它不仅与PfATG8部分共定位，还与顶质体、内质网（ER）、线粒体和内质网共定位。另一个关键组分ATG18属于PROPPIN家族磷酸肌醇结合蛋白，在恶性疟原虫（P. falciparum）血液期膜动力学中发挥关键作用。通过与磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的相互作用，PfATG18定位于顶质体和食物泡，调节膜重塑和囊泡运输。其与多药耐药蛋白1（MDR1）的关联进一步将ATG18与自噬相关过程和药物反应机制联系起来。总之，这些蛋白创建了一个有效的自噬系统，帮助寄生虫回收和重建细胞物质以维持生存。

**3 疟原虫中是否存在经典自噬？当前证据与局限性**
尽管鉴定了几个保守的ATG同源物，包括ATG3、ATG4、ATG5、ATG7、ATG8和ATG12，但疟原虫中是否存在经典自噬仍是一个有争议的话题。功能研究表明这些组分存在，但通常被重新用于寄生虫特异性过程，而非经典的大量胞质降解。自噬样活性的早期证据来自对伯氏疟原虫肝期的研究，其中寄生虫发育与自噬性细胞死亡的特征相关，包括膜扩展、囊泡形成和细胞器降解。在胁迫条件下观察到PfATG8阳性囊泡结构，提示自噬样途径的激活。这些发现表明自噬相关过程可能有助于寄生虫生命周期特定阶段的发育调控或程序性细胞死亡。然而，几个关键观察结果反对疟原虫中存在完全功能的经典自噬。寄生虫基因组缺乏关键的上游调控因子如ATG1和ATG13，这些因子在其他真核生物中对于自噬起始至关重要。此外，形成双层膜自噬体并与溶酶体融合以介导大量降解的证据有限。相反，疟原虫似乎拥有一个精简且改良的自噬机制，支持选择性和特化功能。ATG8是疟原虫中研究最深入的自噬蛋白，凸显了这种差异。ATG8并非主要参与胞质回收，而是定位于顶质体，并对其在恶性疟原虫血液期和伯氏疟原虫肝期的维持和遗传至关重要。PfATG8还参与囊泡运输，并可能与食物泡相关的过程有关。食物泡，特别是在恶性疟原虫中，表现出溶酶体样特性，并作为血红蛋白降解、血红素解毒和肽加工的中心场所，这些功能对于红细胞内生存至关重要。自噬相关蛋白如PfATG18进一步支持非经典途径的存在。PfATG18通过磷脂酰肌醇3-磷酸依赖的相互作用定位于食物泡，并调节液泡动力学，包括血液期的膜分裂和融合。在营养胁迫下，PfATG18表达上调并在食物泡积累，表明其在类似自噬但独立于经典自噬体形成的适应性反应中发挥作用。尽管疟原虫主要在胁迫条件下或药物处理期间表现出自噬样特征，但它缺乏酵母或哺乳动物细胞中观察到的完整降解性自噬的明确证据。这些发现支持了疟原虫拥有独特的、多功能非经典自噬途径以适应其寄生生活方式的观点。

**4 疟原虫中的核心自噬机制**
疟原虫中的自噬机制是精简的，仅包含一个ATG蛋白子集，它们共同形成一个最小核心系统。其中，ATG8是最突出且功能上必需的组分，作为自噬膜的关键标志物。与经典系统不同，恶性疟原虫中的ATG8在顶质体生物发生和遗传中发挥核心作用，并且对寄生虫生存不可或缺。尽管尚未实现完全基因敲除，但恶性疟原虫中的条件性敲低研究已证明ATG8对于寄生虫复制和质体维持至关重要。疟原虫中的ATG8结合系统由一个简化但保守的泛素样级联反应组成，涉及ATG7（E1样）、ATG3（E2样）和ATG12-ATG5复合物（以E3样能力发挥作用）。ATG8与磷脂酰乙醇胺的脂化使其能够与膜结合，促进吞噬泡形成和膜扩展。疟原虫ATG8具有一个预先暴露的C端甘氨酸，消除了酵母和哺乳动物中所需的ATG4介导的引物切割。相反，ATG4主要功能是将ATG8从膜上解离，从而调节其在膜结合池和胞质池之间的回收。破坏PbATG4会损害PbATG8的去脂化，导致回收缺陷和PbATG8的补偿性过表达，最终损害血液期寄生虫的适应性。尽管PbATG4对于蚊子期寄生虫发育是非必需的，但PbATG4突变体寄生虫表现出细胞器生物发生受损和肝期裂殖子形成减少。机制上，ATG7通过ATP依赖的腺苷酸化激活ATG8的C端甘氨酸，随后与其催化半胱氨酸形成硫酯中间体。激活的ATG8随后被转移至ATG3，介导其与PE的结合。功能研究进一步强调了这一级联反应的重要性，因为PbATG7突变体寄生虫表现出多效性缺陷，包括细胞器生物发生受损、核分离缺陷和肝期发育减少。尽管PbATG4在蚊子期发育中是非必需的，但PbATG7和PbATG8对蚊子期寄生虫发育的贡献仍未解决，因为这些研究中使用的条件性沉默系统仅在子孢子中活跃。因此，不能排除这些蛋白在配子体、动合子和卵囊发育过程中的潜在功能。结构和生化分析揭示了疟原虫系统中的独特适应。PfATG3包含一个特化的ATG8相互作用基序，而PfATG8本身含有一个在哺乳动物同源物中不存在的顶复门特异性环。这些差异为选择性治疗靶向提供了机会，如破坏PfATG8-ATG3相互作用的小分子抑制剂所证明的。有趣的是，疟原虫中的ATG12-ATG5复合物以非共价方式相互作用，不同于高等真核生物中观察到的共价结合。这种差异反映了向简化且可能更灵活的系统的进化适应。ATG16的证据仍然有限，尽管最近在相关顶复门寄生虫中的研究表明其可能存在。

**5 疟原虫中的非经典自噬途径：细胞器清除与生物发生**
疟原虫中的自噬超越了经典降解途径，并执行对寄生虫发育和细胞稳态重要的非经典功能。这些替代机制适应于寄生虫精简的自噬库，主要涉及细胞器重塑和遗传，而非大量胞质降解。疟原虫中非经典自噬的两个关键例子是细胞器清除和生物发生。

**5.1 通过外泌自噬（Exophagy）进行细胞器清除**
在肝细胞入侵期间，子孢子依赖特化的分泌细胞器，包括微线体和棒状体，以促进宿主细胞进入。入侵并转化为肝期滋养体后，这些细胞器变得多余，必须被有效移除以减少代谢负担。在肝期明显缺乏经典溶酶体区室的情况下，疟原虫采用了一种称为“外泌自噬”的替代机制。外泌自噬整合了自噬和外泌途径以消除多余细胞器。泛素样蛋白PbATG8在这一过程中发挥核心作用，通过与参与吞噬泡样结构的膜结合，并与微线体蛋白如TRAP共定位，表明其参与细胞器消除。ATG8通过E1样酶ATG7与膜结合，促进膜扩展和货物包裹。随后，外泌机制的组分，包括高尔基体相关的GRASP和ESCRT相关的ATP酶VPS4，介导囊泡成熟。自噬体样结构与多囊泡体融合形成两性体（amphisome）样中间体，最终与寄生虫质膜融合。这导致TRAP相关微线体和其他多余细胞器被挤压进入纳虫空泡（PV），在那里被降解。这种混合途径突显了自噬用于细胞外处置而非细胞内降解的独特适应。

**5.2 细胞器生物发生与遗传**
非经典自噬在细胞器扩展和遗传中也发挥关键作用，特别是对于顶质体，这是一个对寄生虫生存至关重要的四膜质体。在肝期发育期间，快速寄生虫复制需要细胞器的广泛生物发生和分离，包括顶质体、内质网和线粒体。ATG8是顶质体动力学的关键调节因子，定位于其最外层膜并介导其伸长、分支和遗传。由ATG7驱动的ATG8结合系统对于维持顶质体完整性至关重要，遗传研究表明破坏PbATG7会导致细胞器生物发生缺陷和寄生虫生长受损。相反，升高的PbATG8水平促进顶质体扩展增强，强调了其调节作用。PbATG7突变体在内质网发育方面受损，直接将自噬途径与细胞器生物发生联系起来。表达PbATG8的转基因寄生虫显示，在肝期寄生虫发育过程中，随着细胞器扩展，ATG8-顶质体共定位增加。ATG8的回收由去结合酶如ATG4介导，后者调节膜结合和胞质ATG8池之间的平衡。ATG4功能丧失导致脂化ATG8积累、膜动力学缺陷和细胞器分离受损。其他因素，如OTU结构域蛋白酶，可能有助于ATG8去结合，尽管它们的作用似乎部分冗余。这种非经典自噬途径有助于维持细胞器完整性和稳态，支持疟原虫在宿主内的生存和适应。

**6 自噬与抗疟药耐药性**
自噬已成为恶性疟原虫青蒿素（ART）耐药性的重要贡献因素，特别是在携带kelch13（k13）基因突变的寄生虫中。K13蛋白与泛素介导的蛋白周转和氧化应激反应等细胞过程有关，非同义突变（如C580Y、R539T、Y493H）与延迟的寄生虫清除和临床ART耐药性密切相关。群体水平基因组分析揭示了k13突变与自噬相关基因（包括PfATG18）变异（如T38I）的显著共现，表明自噬途径与药物耐药性之间存在功能联系。机制上，ART耐药性寄生虫表现出基础自噬升高，这增强了它们承受药物诱导胁迫的能力。该表型与磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）水平升高相关，PI3P是一种由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）产生的脂质信号分子，调节囊泡运输和自噬起始。耐药性寄生虫中升高的PI3P水平促进其在ART暴露下的生存，而PI3K的药理学抑制降低了寄生虫活力，强调了自噬相关途径的保护作用。除了PI3P信号，自噬与蛋白质稳态和未折叠蛋白反应（UPR）密切相关，这两者对于管理ART诱导的细胞损伤至关重要。青蒿素通过诱导广泛的蛋白质损伤和氧化应激发挥其抗疟活性。作为响应，耐药性寄生虫上调自噬相关蛋白如PfATG8和PfATG18，并显示出自噬样囊泡形成增加。这种反应与UPR激活协调，有助于恢复蛋白质稳态。抑制UPR信号会降低这些自噬标志物的表达，突显了这些途径的相互依赖性。重要的是，k13突变体寄生虫（如C580Y）与野生型菌株相比，表现出更高的PfATG8和PfATG18基础水平，进一步支持了增强自噬在耐药性中的作用。研究表明，PfATG18基因中的单核苷酸多态性（SNP）与患者在接受青蒿素联合疗法后由于半衰期延长而导致的寄生虫清除延迟有关。通过使用CRISPR/Cas9将T38I突变引入k13编辑的Dd2寄生虫中进行了研究。因此，该突变赋予了强大的青蒿素耐药性，并导致寄生虫在营养胁迫下存活率提高。因此，在ART耐药性恶性疟原虫中，自噬作为一种生存机制发挥作用，类似于其在癌细胞中的作用，通过维持细胞稳态和促进对胁迫的适应。最近，通过逐步氯喹选择，研究人员生成了缺乏经典耐药性突变的耐药性约氏疟原虫（P. yoelii）寄生虫。耐药性与自噬抑制相关，而敏感寄生虫在药物压力下表现出明显的ATG5、ATG8和ATG12上调，支持自噬介导的细胞死亡，并表明自噬抑制是氯喹耐药性的另一种机制。寄生虫的食物泡，一种负责血红蛋白降解和氨基酸生成的溶酶体样细胞器，与自噬相关过程协同作用，以维持恶性疟原虫在药物压力下的代谢需求。

**7 结论**
疟原虫中的自噬代表了一个高度适应且非常规的细胞过程，与模型真核生物中描述的经典途径显著不同。尽管只拥有一个精简的自噬相关蛋白库，但寄生虫已进化出一个简化而高效的系统，在其复杂生命周期中发挥重要作用。该机制的核心是ATG8，其组成型膜关联以及在顶质体维持中的关键参与，强调了从大量胞质降解向细胞器特异性调节的功能转变。保守的ATG8结合系统，涉及ATG7、ATG3和ATG12-ATG5复合物，以显著的结构和机制修改运行，反映了对寄生虫细胞内生态位的进化适应。积累的证据表明，经典降解性自噬在疟原虫中要么不存在，要么非常有限，而自噬相关过程反而支持特化功能，如细胞器生物发生、囊泡运输和阶段特异性分化。非经典途径，包括外泌自噬介导的细胞器清除和ATG8依赖的顶质体遗传，突出了该系统在动态发育条件下维持细胞稳态的多功能性。这些过程在宿主转换期间尤为关键，此时需要快速重塑和代谢重编程。重要的是，自噬已成为抗疟药耐药性的关键贡献因素，特别是在携带与青蒿素耐药性相关的kelch13突变的寄生虫中。增强的自噬样活性，加上升高的PI3P信号和应激反应途径（如未折叠蛋白反应）的激活，使寄生虫能够在药物诱导胁迫下生存。这使自噬相关蛋白成为有希望的治疗干预靶点。未来研究应侧重于阐明非经典自噬的分子机制，鉴定寄生虫特异性调控因子，并开发利用寄生虫与宿主途径之间结构差异的选择性抑制剂。对这些独特适应的更深入了解不仅将推进基础细胞生物学，还将促进对抗疟疾的创新策略的开发。

**8 治疗意义与未来方向**
疟原虫中自噬的独特且分化的特性为开发新型抗疟策略提供了有希望的机会。与哺乳动物系统不同，寄生虫依赖于一个精简的自噬机制，具有独特的结构和功能适应，特别是在ATG8结合途径中。这种差异为选择性靶向寄生虫特异性组分（如ATG3和ATG7）提供了治疗窗口，而不会显著影响宿主自噬。抑制血液期PfATG7和肝期PbATG7的小分子抑制剂，或破坏关键相互作用（包括PfATG8-ATG3界面）的抑制剂，已显示出潜力，突显了靶向该途径的可行性。此外，自噬相关过程在青蒿素耐药性中的参与强调了其临床相关性。通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶信号或干扰应激反应途径（如未折叠蛋白反应）来调节自噬，可能增强寄生虫对现有药物的敏感性并帮助克服耐药性。因此，包含自噬抑制剂的联合疗法可能代表一种有前景的方法。未来研究应优先鉴定寄生虫特异性调控因子，进行自噬蛋白的结构表征，并验证体内药物靶点。此外，对非经典自噬机制（特别是与细胞器维持和寄生虫发育相关的机制）的更深入了解将至关重要。这些见解将为针对疟疾的创新靶向干预措施铺平道路。