ZDHHC18-YTHDF2轴抑制USP13驱动心肌肥厚

《Pharmacological Research》：ZDHHC18-YTHDF2 Axis Suppresses USP13 to Drive Cardiac Hypertrophy

　　

心肌肥厚（cardiac hypertrophy）是对各种应激因素的重要病理反应，常最终导致心力衰竭（heart failure），因此需要识别新的调控靶点以开发有效的治疗策略。在本研究中，研究人员通过整合转录组学和蛋白质组学分析发现，去泛素化酶13（USP13）在心肌肥厚过程中显著下调。随后的功能实验证实，USP13过表达显著改善了横向主动脉缩窄（TAC）诱导的心功能障碍，并减轻了心肌细胞肥大，表明USP13作为该病理状态的潜在抑制因子。机制研究表明，USP13结合并去泛素化分选连接蛋白13（SNX13），从而稳定SNX13蛋白。SNX13促进Nrf2的核积累，上调关键铁死亡（ferroptosis）相关基因包括SLC7A11和GPX4，从而减轻铁死亡并改善心肌肥厚。此外，m⁶A阅读器YTHDF2被发现结合m⁶A修饰的USP13 mRNA，促进其降解并导致USP13表达降低。研究人员还确定，棕榈酰转移酶ZDHHC18通过介导YTHDF2的S-棕榈酰化（S-palmitoylation），特别是Cys468位点，增强YTHDF2的稳定性。本研究鉴定了心肌肥厚中一个功能性ZDHHC18/YTHDF2/USP13/SNX13/Nrf2/铁死亡信号轴，突出了其作为治疗靶点的潜力。

心肌肥厚是对血流动力学压力或病理刺激的生理性心肌适应，但持续病理性肥厚最终导致失代偿，表现为舒张功能障碍、收缩力降低及心力衰竭风险显著升高。目前针对其病理生理学的治疗手段有限，亟需发现新的调控靶点。已有研究涉及机械应力、氧化应激、能量代谢及神经激素激活等信号通路，但心肌肥厚的分子机制尚未完全阐明。基于此，本研究通过整合转录组学和蛋白质组学分析，在横向主动脉缩窄（TAC）诱导的小鼠心肌肥厚模型中鉴定出去泛素化酶13（USP13）在mRNA和蛋白质水平均显著下调，提示其可能作为关键调控因子。研究人员进一步探索了USP13在心肌肥厚中的功能及上游调控机制，旨在揭示新的治疗靶点。该论文发表在《Pharmacological Research》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：动物模型（8–10周龄雄性C57BL/6J小鼠，来自哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心）行TAC手术建立压力超负荷模型；细胞模型（新生1–3天Sprague-Dawley大鼠心肌细胞NRCMs）经血管紧张素II（Ang II）处理诱导肥大；整合转录组（RNA-seq）和蛋白质组学（label-free定量）分析筛选差异表达基因/蛋白；腺相关病毒9（AAV9）和慢病毒介导的基因过表达/敲低；Western blot、qPCR检测蛋白/mRNA表达；甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP-qPCR）检测m⁶A修饰；RNA免疫沉淀（RIP-qPCR）验证蛋白-RNA结合；酰基-生物素交换（ABE）实验检测棕榈酰化；免疫共沉淀（Co-IP）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定相互作用蛋白；免疫荧光染色、亚细胞分级、铁含量和脂质过氧化检测（MDA、GSH、ROS、4-HNE、JC-1等）评估铁死亡。

研究结果如下：

**3.1 建立心肌肥厚模型**：通过TAC手术和Ang II处理分别建立小鼠和细胞肥大模型。超声心动图、心脏重量/体重比、组织学染色（H&E、WGA）及肥大标志物（β-MHC、BNP）检测确认模型成功建立。

**3.2 USP13作为减轻心肌肥厚的新靶点**：整合转录组和蛋白质组分析发现USP13在TAC组中显著下调。AAV9介导的USP13过表达明显改善TAC小鼠的左心室射血分数（EF）和缩短分数（FS），降低心脏重量/体重比和心脏重量/胫骨长比，减少心肌细胞横截面积，并下调β-MHC和BNP蛋白表达。体外慢病毒过表达USP13同样减小Ang II处理的心肌细胞面积，降低肥大标志物mRNA和蛋白水平。

**3.3 m⁶A修饰导致心肌肥厚中USP13下调**：USP13 mRNA稳定性在Ang II处理后显著降低，而全局m⁶A水平升高。甲基转移酶METTL3和WTAP在Ang II处理的心肌细胞中上调，敲低两者可恢复USP13表达并减少其m⁶A修饰。m⁶A阅读器YTHDF2在肥大心肌细胞中表达升高，沉默YTHDF2增强USP13 mRNA稳定性并恢复其蛋白水平。MeRIP-qPCR和RIP实验证实YTHDF2结合USP13 mRNA的第四个m⁶A位点（位于3‘UTR）；突变该位点消除YTHDF2结合，抑制mRNA降解，并减轻细胞肥大。

**3.4 ZDHHC18在心肌肥厚中调控YTHDF2棕榈酰化**：ABE实验显示YTHDF2在肥大心肌细胞中发生S-棕榈酰化，且被棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸（2-BP）抑制。棕榈酰转移酶ZDHHC18在体内外肥大模型中表达升高，并与YTHDF2相互作用。敲低ZDHHC18减弱YTHDF2棕榈酰化，加速其蛋白降解（CHX追踪实验）。生物信息学预测及突变验证确认ZDHHC18催化YTHDF2的Cys468位点棕榈酰化。C468S突变体失去棕榈酰化修饰，不能促进USP13 mRNA降解，且不能增强肥大反应。

**3.5 USP13通过Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制心肌肥厚中的铁死亡**：TAC小鼠心脏和Ang II处理的心肌细胞中，普鲁士蓝铁染色阳性比例增加，铁含量、MDA浓度、ptgs2 mRNA升高，GSH浓度降低，ROS和4-HNE积累，细胞活力下降。USP13过表达逆转上述铁死亡相关指标。机制上，USP13增强Nrf2核积累，上调其下游靶基因HO-1、NQO1、SLC7A11和GPX4蛋白表达。

**3.6 USP13结合并去泛素化SNX13**：免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定SNX13为USP13相互作用蛋白。Co-IP和免疫荧光证实两者在心肌细胞内源结合。USP13过表达恢复TAC或Ang II导致的SNX13蛋白下降，CHX追踪显示USP13减缓SNX13降解。MG132（蛋白酶体抑制剂）处理逆转USP13敲低引起的SNX13下调。泛素化实验表明USP13通过去除K48连接的多聚泛素链去泛素化SNX13。结构域截断突变体分析显示USP13的UBA结构域是结合SNX13所必需。

**3.7 SNX13促进Nrf2核积累**：Co-IP证实SNX13与Nrf2直接相互作用。免疫荧光和亚细胞分级显示SNX13过表达增强Nrf2核转位，上调HO-1和NQO1蛋白，降低肥大标志物BNP和β-MHC，减小心肌细胞面积。

**3.8 USP13以SNX13依赖性方式抑制心肌肥厚中的铁死亡**：在Ang II处理的心肌细胞中，USP13过表达联合SNX13敲低逆转了USP13单独过表达的保护作用，表现为铁含量和MDA升高、ROS和4-HNE增加、ptgs2 mRNA上调、细胞活力和GSH下降、线粒体膜电位降低、GPX4和SLC7A11蛋白减少，同时肥大标志物BNP和β-MHC回升。

讨论部分总结：本研究整合多组学分析鉴定USP13为心肌肥厚保护因子，发现其通过去泛素化稳定SNX13，促进Nrf2核积累并抑制铁死亡。上游m⁶A阅读器YTHDF2介导USP13 mRNA降解，而YTHDF2本身被ZDHHC18催化棕榈酰化而稳定。结论部分翻译：总之，本研究证实USP13在心肌肥厚中发挥关键心脏保护作用，得到了强有力的体外和体内证据支持。机制上，USP13通过促进SNX13的K48连接去泛素化来稳定SNX13，进而促进Nrf2核积累并增强其抗铁死亡活性。重要的是，研究人员发现，在心肌肥厚过程中，USP13表达因m⁶A介导的mRNA降解而受到抑制，该过程由阅读器蛋白YTHDF2指导。此外，YTHDF2本身通过棕榈酰转移酶ZDHHC18催化的棕榈酰化而稳定。总之，这些发现揭示了一个新的ZDHHC18/YTHDF2/USP13/SNX13/Nrf2信号轴，该轴调控铁死亡和心肌肥厚。