全反式视黄酸可抑制由严重发热伴血小板减少综合征病毒在小鼠中引发的全身性炎症

《Nature Microbiology》：All-trans retinoic acid suppresses systemic inflammation induced by severe fever with thrombocytopenia syndrome virus in mice

　　摘要：维生素A的代谢物全反式视黄酸具有免疫调节功能，但其在中病毒感染过程中的系统作用尚不清楚。本研究发现，感染新兴蜱传疾病——发热伴血小板减少综合征病毒的患者，其血清维生素A及全反式视黄酸水平显著降低。这一现象与更严重的系统性炎症反应综合征及更高的死亡风险相关。在SFTSV小鼠模型中，腹腔注射全反式视黄酸可通过过氧化物酶体增殖物激活受体-γ抑制病毒引发的过度炎症，进而降低巨噬细胞中激活蛋白-1的转录活性。从机制上看，全反式视黄酸与视黄酸X受体-α结合，促进二者形成异二聚体，该复合物可隔离JUN转录因子，抑制AP-1启动子依赖性基因如IL-6的表达，从而减弱炎症信号通路。我们的研究提示，在SFTSV感染过程中存在视黄酸介导的免疫代谢调控机制，并提出将视黄酸信号通路作为控制细胞因子风暴的治疗靶点。

维生素A是一种重要的脂溶性营养素，储存在肝脏中并以视黄醇形式输送到外周组织。视黄醇最终会被视黄醛脱氢酶氧化为视黄酸，而在大多数组织中以全反式异构体全反式视黄酸为主。全反式视黄酸在细胞质中由CYP26酶降解。进入细胞核后，全反式视黄酸会与视黄酸受体或过氧化物酶体增殖物激活受体结合，这些受体与视黄酸X受体形成异二聚体，通过视黄酸反应元件或过氧化物酶体增殖物反应元件驱动基因转录。在巨噬细胞中，PPARγ可通过拮抗AP-1、STAT-1和NF-κB等促炎转录因子发挥抗炎作用。AP-1是MAPK信号通路的下游效应因子，在感染期间会促进IL-6等炎症细胞因子的表达。维生素A缺乏会增加感染相关的发病率和死亡率，而补充维生素A可减轻埃博拉病毒、麻疹、流感病毒及HIV感染带来的疾病严重程度。发热伴血小板减少综合征是一种由SFTSV病毒引起的新兴蜱传疾病，目前尚无疫苗或特效抗病毒药物。部分患者会出现致命的细胞因子风暴并伴随多器官衰竭，这凸显出控制过度炎症的疗法的迫切需求。由于维生素A缺乏会改变巨噬细胞数量及细胞因子分泌，我们推测维生素A及全反式视黄酸的水平会直接影响机体对SFTSV引发过度炎症的易感性。本研究表明，SFTSV通过扰乱ALDH1A1和CYP26A1的活性，导致维生素A及全反式视黄酸水平下降；全反式视黄酸可通过促进RXRα–PPARγ异二聚体形成，隔离JUN因子，使其无法作用于AP-1及IL-6启动子，从而发挥PPARγ依赖性的抗炎作用。视黄酸缺乏会加剧促炎反应，由此可确定视黄醇代谢障碍是SFTSV引发免疫病理反应的关键机制。维生素A的代谢产物ATRA可通过抑制巨噬细胞相关的系统性炎症反应来保护宿主免受SFTSV感染。因此我们检测了最丰富的视黄酸异构体ATRA对SFTSV的防护作用。在维生素A缺乏的小鼠中，给予ATRA可恢复血清中的视黄酸水平，同时将存活率从20%提升至60%（图3a及扩展数据图3a、b）。接着我们研究了在常规饮食条件下小鼠使用ATRA的效果。ATRA处理显著降低了IL-6和TNF的表达，改善了肺、肝和脾脏组织中的病理变化，且并未影响这些器官中的病毒载量（图3b及扩展数据图3c–g）。

图3：维生素A代谢物ATRA通过靶向巨噬细胞中的AP-1转录活性来抑制SFTSV引发的系统性炎症。全尺寸图像：a，经过IFNAR1阻断和SFTSV感染处理后，喂食维生素A缺乏饮食的WT B6小鼠的生存率分析（n=10），显著性通过对数秩检验确定。b，ATRA处理后的WT B6小鼠在感染3天后，脾脏、肺和肝脏中IL-6 mRNA的表达水平。c，SFTSV感染48小时后，mBMDMs中IL-1b、IL-6和TNF mRNA的抑制情况（n=3）。d，ATRA预处理可抑制从hPBMCs中提取的SFTSV感染人类单核细胞中IL-1B、IL-6和TNF的表达（n=6）。e，经过ATRA预处理并感染SFTSV48小时后的THP-1细胞中，通过RNA-seq测定的mRNA表达热图，FPKM表示每百万映射读数对应的每千碱基片段数。f，经过ATRA预处理并感染SFTSV48小时后的THP-1细胞中的MAPK信号通路蛋白（n=6）。g，喂食溶媒或ATRA处理、感染SFTSV3天后的WT B6小鼠脾脏中的MAPK信号通路蛋白（n=4）。h、i，体外培养的经TLZ处理、感染SFTSV的mBMDMs中Jun和Fos的转录水平（h）以及JUN和FOS的蛋白表达和磷酸化水平（i）（n=6）。j、k，感染SFTSV3天后的经TLZ处理小鼠脾脏中Jun和Fos的转录水平（j）以及JUN和FOS的蛋白表达和磷酸化水平（k）（n=5–6）。对于在不同凝胶上检测的样本，所有凝胶均在相同条件下同步处理，且使用来自同一实验的样本。数据为至少两次独立实验的平均值±标准差。对于所有条形图，组间差异通过双尾学生t检验判断。

为了在细胞层面验证这些抗炎作用，我们采用了体外模型。ATRA显著降低了SFTSV感染的小鼠BMDMs、PBMCs和RAW264.7细胞中IL-1b、IL-6和TNF的水平，且未影响病毒复制（图3c及扩展数据图3h–j）。与这些观察结果一致，经ATRA预处理的人类单核细胞也表现出IL-6和TNF表达水平显著降低（图3d）。在人类巨噬细胞系THP-1中进一步研究了ATRA的抑制作用。ATRA能剂量和时间依赖性地降低IL-6和TNF（但非IL-1β）的mRNA和蛋白水平，同样不影响病毒复制（扩展数据图4a–d）。此外，I型干扰素的表达仅在感染后期（48小时）有轻微下降，而在感染早期（8小时）则无变化（扩展数据图4e）。总体而言，这些结果表明ATRA能够独立于直接的抗病毒活性，特异性地抑制SFTSV引发的巨噬细胞相关系统性炎症。

ATRA对SFTSV引发的炎症反应的抑制作用与巨噬细胞中的AP-1转录因子有关。为探究ATRA抗炎作用的分子机制，我们对THP-1巨噬细胞在四种不同条件下的RNA进行了测序：对照组、仅SFTSV感染组、仅ATRA处理组以及ATRA与SFTSV共同处理组。基因集富集分析显示，ATRA倾向于下调参与促炎信号通路的基因，尤其是MAPK级联反应和细胞因子生成相关基因（扩展数据图4f）。与之相应，ATRA抑制了SFTSV诱导的MAPK相关基因FOSB和JUNB的表达，而与NF-κB（NFKB2和RELA）或炎性小体（NLRP3和CASP1）相关的基因则保持不变（图3e）。接下来我们研究了MAPK信号通路的下游关键效应因子AP-1复合体。SFTSV感染显著提升了THP-1细胞中FOS和JUN的表达及磷酸化水平，同时JNK的磷酸化也有所增加。值得注意的是，这种激活并未伴随上游MAPK成分如TAK1、MKK3/6、MKK4、JNK和p38的显著上调（图3f及扩展数据图4g）。ATRA预处理有效抑制了SFTSV诱导的FOS/JUN表达以及JNK、FOS和JUN的磷酸化，而病毒核衣壳蛋白N的水平则保持不变，这说明该作用属于免疫调节作用而非抗病毒作用。重要的是，ATRA对未感染细胞中的这些信号分子没有明显影响，进一步体现了ATRA作用的特异性（图3f及扩展数据图4g）。在原代小鼠BMDMs中也得到了类似的结果（扩展数据图5a、b）。与转录组数据一致，ATRA并未调控NF-κB通路的关键成分（MyD88、TRAF6和IKKβ）或NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、caspase-1和GSDMD）（扩展数据图5b、c）。

为了在体内验证这些发现，我们先给小鼠预处理ATRA，然后在感染3天后检测脾脏巨噬细胞中的MAPK通路分子。与溶媒对照组相比，ATRA显著降低了Tak1、Mkk3/6、Mkk4/7和p38（也称为Mapk14）的mRNA水平。然而，TAK1、p-TAK1、MKK4或p38的蛋白水平，以及JNK的基因、蛋白或磷酸化水平均无显著差异（图3g及扩展数据图5d）。值得注意的是，与溶媒对照组相比，ATRA显著降低了FOS、p-FOS和p-JUN的表达，同样未改变NP水平（图3g及扩展数据图5d）。这些结果表明，在SFTSV感染期间，ATRA对脾脏巨噬细胞中的MAPK通路成分具有不同的调控作用。我们进一步研究了内源性ATRA的作用，使用TLZ来维持ATRA水平。TLZ预处理显著抑制了SFTSV诱导的FOS和JUN表达上升（图3h）以及它们的蛋白和磷酸化水平上升（图3i），这一效果与它抑制IL-1β和IL-6生成的效应类似（图2m、n及扩展数据图2f）。这一现象在体内也得到了证实：TLZ处理显著降低了感染3天后脾细胞中AP-1组分的表现型和磷酸化水平（图3j、k），且未影响病毒复制（图3i、k）。总体而言，这些结果表明，持续稳定的ATRA浓度可通过抑制巨噬细胞中AP-1转录因子FOS和JUN的活化，从而在SFTSV感染期间发挥抗炎作用。

ATRA在巨噬细胞中抑制SFTSV相关的炎症反应需要PPARγ的参与。PPARγ是已知可调控巨噬细胞极化、成熟和代谢的因子，同时也被认为能在病毒感染期间发挥抗炎作用。因此我们探讨了ATRA是否通过PPARγ来抑制SFTSV引发的炎症。RNA-seq分析显示，SFTSV感染显著降低了THP-1细胞中的PPARG基因表达，而PPARA和PPARD则未受影响（图4a）。这一发现通过在THP-1细胞和原代小鼠BMDMs中进行的定量PCR验证得到确认（扩展数据图6a）。

图4：ATRA通过PPARγ依赖性的AP-1转录重编程来减轻SFTSV引发的巨噬细胞炎症。全尺寸图像：a，通过转录组分析识别SFTSV感染与对照组THP-1巨噬细胞中差异表达的基因，显著性通过DESeq2软件包中的双侧Wald检验确定，调整后的P值采用Benjamini–Hochberg方法进行多重比较校正以控制假阳性率。b、c，使用siRNA敲低PPARγ可消除ATRA对感染THP-1细胞中IL6（b）、JUN和FOS（c）mRNA的抑制作用，siNC为随机阴性对照siRNA；ATRA浓度为10微摩尔，处理时间为48小时，每组样本数n=5–7。d，Western blot分析显示PPARγ沉默可同时恢复FOS和JUN的磷酸化水平。e、f，使用选择性拮抗剂GW9662在感染3天后，可逆转ATRA在 mice的肝脏、肺部和脾脏中引起的IL6抑制作用（e），以及血清中IL-6水平的下降（f），每组样本数n=6。g，Western blot检测显示，使用GW9662加ATRA处理后，脾脏中IL-6蛋白水平有所回升。h、i，GW9662与ATRA联合处理可恢复感染脾脏中Jun和Fos的转录水平（h），以及FOS和JUN的蛋白表达水平（i）。j，原代PPARγ敲除小鼠的BMDMs也表现出与ATRA处理相似的IL6、JUN和FOS抑制作用丧失的现象，每组样本数n=5–6。k、l，髓系特异性的PPARγ敲除可消除ATRA在SFTSV感染小鼠脾脏组织中引起的IL6、JUN和FOS mRNA表达及蛋白表达的抑制作用，每组样本数n=6。m，对PpargΔMφ小鼠及其同窝的Ppargfl/fl小鼠在SFTSV感染后进行生存率分析，是否有ATRA预处理会影响生存率，每组样本数n=10。对于在不同凝胶上检测的样本，所有凝胶均在相同条件下同步处理，且使用来自同一实验的样本，组间差异通过对数秩检验确定，数据为至少两次独立实验的平均值±标准差，涉及两个独立变量的组间比较则采用双因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。

为了直接验证PPARγ的必要性，我们采用了短干扰RNA进行敲低实验。PPARγ沉默不仅提高了基础水平的IL-6表达，还加剧了SFTSV诱导的IL-6升高，同时完全消除了ATRA对IL-6、JUN和FOS及其磷酸化的抑制作用（图4b–d及扩展数据图6c、d）。重要的是，无论是PPARγ敲低还是ATRA处理均未影响病毒复制，因为SFTSV的NP水平保持不变（图4d）。这些数据表明PPARγ是ATRA发挥抗炎作用所必需的。接下来我们使用PPARγ拮抗剂GW9662在体内验证了这些发现。与体外结果一致，GW9662与ATRA联合使用可阻止ATRA对脾脏、肝脏和肺部组织中Il1b、Il6和Tnf的抑制作用，同时也能消除ATRA降低血清和脾脏中IL-6蛋白水平的作用。GW9662还消除了ATRA对AP-1组分（FOS和JUN）的下调作用，以及其对组织损伤的保护作用，不过并未影响病毒载量（图4e–i及扩展数据图6e–j和7a–d）。由此可见，完整的PPARγ信号传导是ATRA发挥抗炎和保护组织作用所必需的。为确定巨噬细胞特异性，我们使用了条件性PPARγ敲除小鼠（Lyz2cre/crePpargfl/fl，记为PpargΔMφ）。ATRA可抑制同窝正常小鼠（Ppargfl/fl）的BMDMs中的Fos、Jun和Il6表达，但在PpargΔMφ小鼠的BMDMs中则无此效应（图4j）。同样在体内，ATRA也无法降低PpargΔMφ小鼠中的这些指标水平（图4k、l及扩展数据图7e、f），且对病毒滴度也没有影响（扩展数据图7g）。生存率分析显示，ATRA可提高Ppargfl/fl小鼠的存活率（60%–80%），但对PpargΔMφ小鼠则无益处，其存活率仅为30%。尽管这些差异未达到统计学显著性，但一致的趋势仍支持PPARγ介导的保护作用（图4m）。综上，这些互补的研究结果表明，巨噬细胞中PPARγ的表达对于ATRA发挥抗炎作用及保护机体免受SFTSV感染至关重要，且这一作用与病毒的清除能力无关。

ATRA通过劫持巨噬细胞中的转录因子JUN来抑制SFTSV引发的炎症反应。通常情况下，ATRA会促使RXR–PPAR二聚体结合到PPPRE上以实现基因激活。但在HEK293T细胞中，ATRA仅轻度增强了PPPRE驱动的PPARγ活化作用，增幅为1.6倍，而其对PPARβ/δ的活化作用则为3倍（扩展数据图8a）。因此我们推测，ATRA是通过一种不依赖于PPPRE的机制、借助PPARγ来抑制AP-1介导的炎症反应，这一机制类似于PPARα通过直接干扰JUN来抑制IL-6的作用。利用PpargΔMφ和Ppargfl/fl小鼠的BMDMs进行的共免疫沉淀实验表明，ATRA并未改变PPARγ蛋白水平，但却降低了JUN的表达，这一结果与转录组数据一致（图3e）。重要的是，ATRA增加了正常巨噬细胞中PPARγ与JUN的结合，而在PpargΔMφ细胞中则不存在这种效应（图5a及扩展数据图8c）。通过检测病毒核衣壳蛋白也可确认两者感染程度相当（图5a）。利用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚进行亚细胞定位分析以及荧光强度检测显示，ATRA以PPARγ依赖的方式增强了PPARγ（红色）与JUN（绿色）在细胞核内的共定位（图5b）。免疫焦点分析排除了感染效率存在差异的可能性（扩展数据图8b）。染色质免疫沉淀结合qPCR分析显示，只有在中性正常BMDMs中，ATRA才能降低JUN与Il6、Fos及其自身启动子区域的结合程度（图5c）。

图5：ATRA通过促进PPARγ依赖性的JUN在巨噬细胞中的隔离作用，来抑制SFTSV引发的炎症反应。全尺寸图像：a，对经ATRA处理或未处理的SFTSV感染的Ppargfl/fl和PpargΔMφ小鼠的BMDMs中PPARγ与JUN相互作用的共免疫沉淀分析，处理时间为48小时，每组样本数n=3。IB表示免疫印迹检测，IP表示免疫沉淀检测。b，共聚焦显微镜图像显示了经ATRA处理或未处理的SFTSV感染的Ppargfl/fl（上方）和PpargΔMφ（下方）小鼠BMDMs中PPARγ与JUN的亚细胞定位情况，细胞核用DAPI染成蓝色，顶部面板中所示细胞的荧光强度分析所使用的区域由白色虚线标出。各通道的荧光强度分布图显示了相应位置上的荧光强度，用以说明核定位及共定位情况。c，对经ATRA处理的Ppargfl/fl和PpargΔMφ成骨细胞中JUN与Il6、Fos及Jun启动子结合情况的ChIP–qPCR检测（n=4–7）。d，在表达RXRα-LBD或PPARγ-LBD或这两种受体LBD结构域的HEK293T细胞中进行的生物素-ATRA拉下实验（n=3）。e，在经ATRA处理及未处理的Ppargfl/fl和PpargΔMφ成骨细胞中检测RXRα–PPARγ–JUN复合物的拉下实验（n=3）。f，对经ATRA处理及未处理的感染SFTSV的Ppargfl/fl和PpargΔMφ小鼠的脾细胞进行共免疫沉淀分析（感染后3天；n=5）。g，对经ATRA处理及未处理的感染SFTSV的Ppargfl/fl和PpargΔMφ小鼠的脾细胞中JUN与Il6及Jun启动子结合情况的体内ChIP–qPCR检测（n=5）。对于在不同凝胶上检测的样本，所有凝胶均在相同条件下同步处理，且使用来自同一实验的样本。数据为至少两项独立实验的平均值±标准差。涉及两个独立变量的组间统计比较采用双因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。

为研究直接结合机制，我们合成了具有生物活性的生物素-ATRA（扩展数据图8d）（扩展数据图8e）。在表达全长RXRα、全长PPARγ或二者兼有的HEK293T细胞中进行的拉下实验表明，生物素-ATRA可与全长RXRα结合，但无法单独与全长PPARγ结合；只有当全长PPARγ与全长RXRα共同表达时才能被拉下（图5d）。因此，ATRA是通过依赖RXRα的异二聚体与PPARγ结合的。在原代巨噬细胞中，生物素-ATRA可在Ppargfl/fl和PpargΔMφ细胞中拉下RXRα，此外还能在Ppargfl/fl细胞中拉下PPARγ和JUN，而在PpargΔMφ细胞中则不能。敲除细胞中仍存在的JUN信号可能反映了其与其它响应ATRA的受体如PPARα的相互作用（图5e）。在体内，ATRA能增强对照组小鼠脾细胞中的PPARγ–JUN复合物形成，而PpargΔMφ小鼠则无此效应（图5f）。ChIP分析证实，ATRA可特异性降低对照组脾细胞中JUN与Il6及Jun启动子的结合，而在PPARγ缺陷小鼠中则无此作用（图5g）。总体而言，ATRA促进了RXRα–PPARγ异二聚体的形成，该复合物将JUN从AP-1驱动的启动子（如Il6）处隔离出来，从而减弱SFTSV感染期间的炎症级联反应。

大量证据表明，维生素A的代谢及其活性代谢物ATRA在病毒感染后的炎症消退过程中起着关键作用36,37,38。然而，ATRA调控巨噬细胞相关炎症反应的分子机制至今仍不完全清楚。在此，我们发现了一个ATRA与PPARγ轴，该轴能够整合免疫学和代谢信号，进而调控巨噬细胞活性以及由SFTSV感染引发的系统性炎症（扩展数据图8g）。我们的研究进一步深化了人们对宿主微量营养素代谢在限制致病性巨噬细胞功能方面所起作用的认知，尤其是在SFTSV及其他系统性病毒病原体引发的SIRS反应中。我们的研究还发现了维生素A缺乏与SFTSV感染患者的SIRS严重程度及死亡风险之间存在密切的临床关联，这一发现扩展了此前关于严重呼吸道感染中维生素A耗竭的研究成果39,40。尽管这些研究表明维生素A代谢紊乱是严重SFTSV及其他传染病的特征，但由于我们的临床队列为横断面设计，因此无法得出确定的因果关系。血清中维生素A水平的下降及其代谢途径的抑制，很可能反映了严重感染所引发的系统性病理状态——在这种状态下，炎症引起的食欲减退、吸收不良以及细胞代谢重编程共同加速了营养素的消耗。我们构建的对照小鼠模型为急性SFTSV感染会导致循环中维生素A快速流失提供了直接的实验证据，这一现象与系统性炎症的发作时间相吻合（图1d）。因此，虽然人类数据揭示了两者之间的重要临床关联，但小鼠模型证实了感染本身即可导致维生素A的耗竭。

从机制上来看，SFTSV感染会通过酶活性的协调失调破坏视黄酸的稳态：即视黄酸合成酶ALDH1A1的表达下调，而视黄酸降解酶CYP26A1的表达上调。值得注意的是，这种酶活性失衡在多种病毒性疾病中均有类似表现——先前有研究显示猪流感病毒（H3N2）感染的呼吸道上皮中也存在ALDH1A1表达下调的现象41，而COVID-19的活检研究则发现SARS-CoV-2引起的气管病变中也存在ALDH1A2表达受抑的情况42。所观察到的CYP26A1表达上调延续了这种普遍存在的病毒策略，与Epstein–Barr病毒（EBV）通过BZLF1蛋白增强视黄酸反应性CYP26A1表达的机制类似43，这表明存在一种跨病毒的机制，可用于加剧视黄酸代谢紊乱。转录组学和生化分析结果显示，ATRA可选择性地抑制与AP-1相关的促炎基因，而对NF-κB和炎性小体通路则影响不大，这种具有情境依赖性的作用方式与先前的研究结果有所不同——先前研究发现，ATRA可通过抑制肠道上皮中的TLR3–TLR4–RIG-I途径来减轻传染性胃肠炎病毒引发的炎症38,44。这些不同的调控模式凸显出ATRA抗炎活性的情境依赖性，其作用既受目标细胞类型的调控，也受病毒致病机制的影响。

在我们的研究中，我们进一步阐明了ATRA发挥抗炎作用的一种依赖于PPARγ的机制：ATRA可促进巨噬细胞中RXRα–PPARγ异二聚体的形成，进而形成一个转录调控复合物，该复合物可直接靶向AP-1亚基JUN。重要的是，这种抑制作用是通过非经典的、蛋白质-蛋白质相互作用介导的JUN转录抑制机制实现的，而非传统的PPRE依赖性抑制机制（扩展数据图8g），这一机制与先前关于PPARα–JUN相互作用在抑制人主动脉平滑肌细胞中IL-6生成中的作用机制相似45。这种机制干扰了AP-1与IL-6启动子之间的相互作用，从而抑制了MAPK驱动的炎症级联反应以及SFTSV感染期间的病毒诱导的过度炎症。为探索其临床应用潜力，我们已在SFTS患者中开展了一项前瞻性单盲随机对照试验（ChiCTR2300076238）。

本研究存在若干局限性。用于验证临床关联的样本量相对较少，因此需要更大规模的多中心研究来确认维生素A和ATRA水平与疾病严重程度之间的关系。由于没有感染前的营养状况基线数据，我们难以在人类研究中确定直接的因果关系。此外，PPARγ与JUN之间的精确分子相互作用仍需在未来通过纯化蛋白进行结构学或生物物理学研究来进一步探究。

总体而言，我们的研究揭示了一个关键的代谢-免疫轴，即维生素A及其代谢物ATRA的缺乏在机制上将严重的SFTSV感染与加重的SIRS联系在一起。此外，我们还明确了病毒诱导的视黄酸代谢紊乱如何引发严重的免疫病理反应，同时找到了一个可作为治疗靶点的免疫代谢检查点，用于干预病毒引起的过度炎症。

**伦理审批**
本研究严格遵循所有相关的伦理规范进行。患者招募及生物样本采集方案已获得军事医学科学院伦理委员会的批准（批准编号AF/SC-08/02.72）。所有参与者在入组前均签署了书面知情同意书，同时也会因参与临床研究而获得相应的补偿。

**患者与样本收集**
2022年5月至8月期间，根据中国卫生部门制定的诊断标准，我们从河南省信阳市154医院招募了31名确诊为SFTSV感染的成年患者（24名存活者，7名死亡者；平均年龄分别为62岁和74岁；女性15名）。患有肿瘤、结核病、心脏病、血液疾病或其他传染病（如肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、登革热病毒、立克次体病及伯氏疏螺旋体病）的患者已被排除在外。临床表现及实验室检测数据均来自电子病历。所有患者在出院后2周内都会通过电话或上门访视的方式接受随访，以确定最终的生存状况。此外，我们还在研究期间从同一地区招募了15名健康对照组受试者（平均年龄61岁；女性7名）。入选受试者的详细人口统计学及临床特征，包括年龄和性别分布，见扩展数据表1。我们从这31名患者和15名健康受试者身上采集了血清样本，用于测定维生素A、视黄酸及IL-6的含量。维生素A浓度是通过CUSABIO公司生产的商业ELISA试剂盒（CSB-E07889h）测定的。视黄酸含量则是利用基于超高效液相色谱-串联质谱技术的靶向代谢组学平台（Acquity-I Xevo TQ-S，Waters公司）进行测定的，分析服务由MetaboProfile公司提供。人类IL-6的血清浓度则是通过MultiSciences公司生产的相应ELISA试剂盒（EK106）测定的。

**生物安全**
所有涉及活体SFTSV的实验都在经过军事医学科学院机构生物安全委员会批准的生物安全等级2（BSL-2）或BSL-3实验室中进行（批准编号IACUC-IME-2023-002）。本研究严格遵守所有机构生物安全规范及当地相关法规。

**细胞与病毒**
THP-1细胞（TIB-202）购自美国典型培养物收藏中心（ATCC），并在含有10%胎牛血清（Gibco，10099141）及1%青霉素-链霉素溶液（Gibco，15140122）的RPMI-1640培养基（Gibco，11875093）中培养。RAW264.7细胞（TIB-71）、Vero细胞（CCL-81）及HEK293T细胞（CRL-3216）也购自ATCC，同样在含有上述成分的DMEM培养基（Gibco，11995065）中培养。所有细胞均在含5%二氧化碳的湿润环境中的37℃下培养。为使THP-1细胞分化，实验前需将其与100 ng/ml的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA；Sigma-Aldrich）共同培养24小时。随后，我们将THP-1PMA细胞分别用ATRA（10 μM）、DEAB（10 μM）和TLZ（10 μM）处理，以检测这些物质对炎症因子水平的影响。所有商业购买的细胞系都经过了供应商（ATCC）通过短串联重复序列分析进行过鉴定。小鼠成骨细胞则是通过标准化方法从6周龄的野生型C57BL/6J小鼠中分离得到的。首先从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓，并将其置于DMEM培养基中。所得细胞悬液再通过70微米筛网过滤，得到单细胞悬液。过滤后，这些细胞被接种到含有10%胎牛血清、30%L929上清液及1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中培养。在37℃、含5%二氧化碳的环境中培养3天后，更换含有10%胎牛血清、20%L929上清液及1%青霉素-链霉素溶液的新培养基。到第6天时，可通过流式细胞术检测培养细胞的纯度，使用抗CD11b抗体和抗F4/80抗体进行双染色后，其纯度可达到约98%（扩展数据图8f）。随后，我们将这些成骨细胞用ATRA（10 μM）、DEAB（10 μM）和TLZ（10 μM）处理，以检测这些物质在感染后24小时对炎症因子水平的影响。小鼠外周血单核细胞则是通过专用的小鼠外周血单核细胞分离试剂盒（TBD），按照制造商的指导原则，通过密度梯度离心法分离得到的。分离完成后，这些细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中于37℃下培养。我们还将这些小鼠外周血单核细胞用10 μM的ATRA处理，以检测其在感染后24小时对炎症因子水平及病毒载量的影响。人类外周血单核细胞则是通过密度梯度离心法从健康志愿者身上分离得到的。具体操作为：从健康志愿者体内采集肝素抗凝的外周血，然后使用Ficoll-Paque Plus密度梯度介质（Cytiva，17144002）进行细胞分离，最终从缓冲层中收集单核细胞。这些细胞随后在37℃、含5%二氧化碳的X-VIVO培养基（Lonza公司）中培养。我们同样将人类外周血单核细胞用ATRA（10 μM）、DEAB（10 μM）和TLZ（10 μM）处理，以检测其在感染后24小时对炎症因子水平的影响。SFTSV HBMC16_human_2015株病毒是从国家病毒资源中心获得的。该病毒在Vero细胞中繁殖后，被用于本研究所进行的各项实验。THP-1细胞、成骨细胞、外周血单核细胞等均需在指定感染复数下与SFTSV共同培养2小时（除非另有说明），之后再进行后续实验。

**流式细胞术分析**
我们将大约1×10^6个培养好的成骨细胞与1微克的抗CD16/32抗体（BioLegend，101320）一起培养10分钟，以防止免疫球蛋白与非特异性地结合到Fc受体上。之后，根据制造商的建议，向每个培养管中加入适当浓度的预稀释的抗小鼠CD11b-PerCP-Cy5.5抗体（大鼠来源，克隆M1/70；MultiSciences公司，编号F41011b04，稀释比例为1:200）以及抗小鼠F4/80-PE抗体（大鼠来源，克隆BM8.1；MultiSciences公司，编号F21480A02，稀释比例为1:200）。随后，将这些细胞在4℃的黑暗环境中培养30分钟，再用PBS洗涤两次。流式细胞术分析则是使用BD Biosciences公司的FACSVerse系统进行的，FSC和SSC阈值分别设置为1,000，检测采用对数刻度。我们共记录并分析了30,000到150,000个细胞事件，分析软件为FlowJo（Tree Star公司）。具体的分群策略详见扩展数据图8f。

**免疫聚焦分析**
将SFTSV感染的样本依次稀释10倍，然后与铺满的Vero细胞单层共同培养2小时。去除接种的病毒后，将含有2%胎牛血清和1.25%羧甲基纤维素的DMEM培养基加入细胞中，继续培养72小时。之后，用4%的甲醛固定细胞，再用0.5%的Triton X-100在PBS溶液中处理细胞以使其通透，最后使用小鼠抗SFTSV NP抗体（浓度为0.75 μg/ml）进行免疫染色，随后再用HRP标记的抗小鼠二抗（稀释比例为1:1,000）进行二次染色。通过定量分析焦点数量来确定病毒滴度。动物实验：从南京大学模式动物研究中心购买的WT B6小鼠被饲养在湿度受控（22±2℃，50%±10%）且无特定病原体的环境中，光照时间为12小时，黑暗时间也为12小时，可自由获取食物和水。所有动物实验均严格遵循军事医学科学院动物护理与使用委员会批准的方案（IACUC-IME-2023-002）进行。Lyz2-Cre小鼠购自赛根生物科技，Pparg-flox小鼠由王Y提供。PPARGFL/FL小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交，从而得到Lyz2Cre/CrePPARGFL/FL（PPARGΔMφ）小鼠。在确定样本量时并未使用任何统计方法，但我们的样本量与以往的研究报告中的相似27。数据收集和分析并非以盲法方式进行。除非另有说明，6周龄、性别匹配的WT B6或相关基因敲除小鼠在腹腔内接种60,000 plaque-forming units的悬浮于100μl PBS中的SFTSV 24小时前，会接受0.35 mg/kg的抗IFNAR1 IgG注射。在指定时间点采集血液样本以及肝脏、肺脏、脾脏等器官样本，用于重量分析、匀浆处理、病毒定量，以及利用先前确定的引物和探针组通过qPCR检测促炎细胞因子27。为研究维生素A在SFTSV致病中的作用，WT B6小鼠被允许自由食用VRD饮食、VDD饮食（FB-A10022，无锡凡博生物技术）或标准对照饮食（FB-A10021B，无锡凡博生物技术），喂养时间为42天。经过28天的饮食调整后，小鼠按照前述方法接受抗IFNAR1预处理并接种SFTSV，随后观察14天的死亡率。在通过药物干预研究维生素A代谢调节时，WT B6小鼠在按照标准抗IFNAR1–SFTSV接种方案处理之前，连续3天每天接受ALDH1A抑制剂DEAB（10 mg/kg，MedChemExpress）或CYP26A1抑制剂TLZ（1 mg/kg）的腹腔注射。在ATRA保护作用研究中，WT B6小鼠先接受28天的VDD饮食，之后连续5天通过口服灌胃方式给予3 mM ATRA。这种预处理方案在标准抗IFNAR1 IgG注射和SFTSV接种之前实施，随后再观察14天的死亡率。在PPARγ拮抗剂干预研究中，WT B6小鼠先连续14天每天口服GW9662（MedChemExpress，化学文摘社编号22978-25-2，HY-16578；浓度为1 mg/kg，溶解在含10% DMSO和90%玉米油的100μl溶剂中），之后再进行5天的ATRA补充治疗（通过口服灌胃给予300 μg）。这种药物预处理在标准抗IFNAR1–SFTSV接种方案之前实施。在感染后3天和5天时采集组织样本，进行包括通过qPCR测定病毒载量、通过ELISA检测促炎细胞因子以及通过苏木精和伊红染色进行组织病理学评估在内的全面分析。维生素A和ATRA水平检测：人类或小鼠血清样本及培养上清液中的维生素A和ATRA水平是依据制造商说明书，使用ELISA试剂盒（小鼠维生素A ELISA试剂盒，CUSABIO；小鼠视黄酸ELISA试剂盒，吴希生物）进行测定的。定量RT-PCR：根据制造商的方案，使用FreeZol试剂（Vazyme）从经珠子匀浆处理后的组织样本或培养细胞中提取总RNA。随后使用HiScript II One-Step SYBR Green试剂盒（Vazyme）进行包含逆转录步骤的定量PCR分析，所用的引物详细信息见扩展数据表2。扩增和检测在Gentier 96R实时PCR系统（TIANLONG）上，在标准循环条件下进行。基因表达水平以各样本内的内参基因GAPDH为基准，通过基于SYBR Green检测的\({2}^-{\Delta}{\Delta}{C}_{\rm{T}}\)方法进行量化。Western blot分析：经过指定处理后的细胞和组织使用RIPA裂解缓冲液（Beyotime）进行裂解。所得裂解液首先通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，之后转移到聚偏二氟乙烯膜上（Millipore）。随后将这些膜与相应的初级抗体一起孵育，然后再与辣根过氧化物酶标记的二级抗体结合。蛋白质条带的使用Vazyme公司的增强型化学发光试剂盒进行检测，并通过Bio-Rad公司的ChemiDoc Touch凝胶成像系统进行可视化。组织组织学和免疫染色：肝脏、肺脏和脾脏先浸入4%多聚甲醛溶液中固定，然后进行脱水处理，再嵌入石蜡中，切成4微米厚的切片。这些切片按照标准流程用苏木精和伊红进行染色。为了进行组织病理学分析和评分，所有组织切片都由两名不知情的病理学家在带有全片数字扫描功能的光学显微镜下进行检查。若出现分歧，则通过协商解决。评分采用半定量评分系统，具体如下46,47,48：肝脏损伤通过改良的NAFLD活动评分系统来评估，该系统用于评价脂肪变性（0–3分）、小叶炎症（0–3分）以及气球样变性（0–3分）。脾脏损伤则根据四个参数评分（每个参数0–3分）：白髓和红髓结构、坏死、淋巴细胞溶解以及血管损伤。肺脏损伤则是根据肺部实变、肺泡壁增厚以及炎症浸润情况来评估（每个参数0–3分）。每种组织的总评分即为各个参数得分的总和。在免疫荧光分析中，去石蜡处理的脾脏切片先使用10%正常山羊血清封闭30分钟，然后在4℃下与抗IL-6多克隆抗体（Proteintech）一起孵育过夜。之后，这些切片在室温下与FITC标记的抗兔二级抗体一起处理55分钟。接着，这些切片在4℃下与抗NP多克隆抗体一起微波处理并染色过夜，之后在室温下与Cy3标记的抗兔二级抗体一起孵育55分钟。最后，这些切片在室温下用DAPI溶液染色10分钟。之后进行显微镜观察，并使用荧光显微镜拍摄图像。促炎细胞因子检测：同样按照制造商的方案，使用FreeZol试剂（Vazyme）从经珠子匀浆处理后的组织样本或培养细胞中提取总RNA。随后使用HiScript II One-Step SYBR Green试剂盒（Vazyme）在Gentier 96R实时PCR系统（TIANLONG）上通过qRT-PCR分析来测定促炎细胞因子的mRNA水平。在蛋白质水平检测方面，血清样本和培养上清液中的IL-1β和IL-6浓度是依据商业化的ELISA试剂盒（小鼠IL-6 ELISA试剂盒，MultiSciences；IL-1β ELISA试剂盒）的说明书进行测定的，光密度值是在450纳米波长处测得的。RNA提取、文库构建、测序及数据分析：使用Trizol试剂（Invitrogen，15596026）从THP-1细胞中提取总RNA。随后按照制造商的方案，使用ALFA-SEQ RNA文库构建试剂盒（Magigene Biotechnology）制备测序文库。高通量测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行（Magigene Biotechnology），最终获得150碱基对的配对末端读段。原始测序数据通过fastp（v0.23.2）49进行质量控制处理，剔除那些符合以下任一条件的读段：长度小于75碱基对、平均质量分数低于15，或者基于4碱基对滑动窗口的质量分数低于20。之后还会去除含有接头污染的以及复杂度较低的序列。剩余的高质量读段则使用HISAT2（v2.2.1）50与人类参考基因组（GRCh38，GCA_000001405.27）进行比对。转录本定量则使用RSEM（v1.3.3）51完成，进而生成用于差异表达分析的计数矩阵，分析过程则借助DESeq2（v1.42.0）52进行。差异表达基因的筛选标准为绝对对数2倍变化率大于1，且FDR值小于0.05。随后使用ClusterProfiler R软件包（v4.12.2）53中实现的基因集富集分析方法，对基因本体论术语和KEGG通路进行功能富集分析，显著性标准设定为FDR值小于0.05。所有的可视化图表都是使用R语言（v4.3.3）中的ggplot2软件包（v3.4.4）生成的。RNA干扰：通过使用Thermo Fisher Scientific公司的Lipofectamine 3000按照制造商的方案，将针对人类PPARG设计的siRNA（由GenePharma公司设计和合成）转染到THP-1细胞中，从而实现基因特异性沉默。转染24小时后，通过qPCR分析PPARG转录本的水平，并以GAPDH作为对照，以此来量化基因敲低的效果，而随机设计的siRNA则用作阴性对照。免疫沉淀实验：将经过处理的组织或细胞在免疫沉淀缓冲液（Beyotime Biotechnology）中裂解。全细胞裂解液作为输入样本，与2微克的靶标特异性抗体一起在4℃下孵育过夜。随后加入预平衡在0.1% PBST（含有0.1% Tween-20的PBS）中的蛋白G磁珠（Bio-Rad），每反应体系加入50微升，然后在4℃下继续旋转孵育4小时。这些磁珠用0.1% PBST洗涤四次，之后通过在1× SDS加载缓冲液中煮沸来释放结合的蛋白质。生物素–ATRA拉下实验：将Streptavidin连接的Dynabeads MyOne T1（Thermo Fisher Scientific）在室温下与生物素或生物素–ATRA在PBS中预结合1小时。之后用0.01% PBST洗涤这些磁珠，然后在4℃下与澄清的细胞裂解液一起孵育过夜。再次用0.01% PBST洗涤四次后，将保留下来的蛋白质复合物洗脱出来，随后进行免疫印迹分析。双荧光素酶报告基因实验：将HEK293T细胞接种在24孔板中，细胞密度控制在70–80%左右，然后同时转染编码小鼠PPARγ-LBD（2号变异体；MR208132，OriGene）、PPARβ/δ-LBD（MR207001，OriGene）的表达质粒，以及由PPRE驱动的萤火虫荧光素酶报告基因54（该报告基因由5′-GTCGACAGGGGACCAGGACAAAGGTCACGTTCGGGAGTCGAC这段核苷酸序列重复三次组成，下划线部分为PPRE共识序列）55，还有Renilla荧光素酶标准化载体（pRL-TK，Promega）。转染操作是按照Thermo Fisher公司的Lipofectamine 3000产品说明书进行的。转染24小时后，这些细胞先在含1μM ATRA的溶液中处理24小时，或者仅用DMSO作为溶剂处理24小时，之后再进行裂解。双荧光素酶活性是使用Beyotime公司的RG028检测系统来测定的，萤火虫荧光强度以Renilla荧光强度为基准进行标准化。所有的转染实验都设置了三份技术重复样本，生物学重复样本的数量则在相应的图例中有说明。ChIP–qPCR实验：ChIP实验是按照Thermo Scientific公司的Pierce Magnetic ChIP Kit（26156）的说明书进行的。简而言之，首先从PPARGFL/FL或Lyz2Cre/CrePPARGFL/FL小鼠身上提取骨髓间充质细胞，然后将这些细胞与含有100纳摩尔ATRA的SFTSV感染液一起孵育48小时，之后用1%甲醛在室温下处理10分钟使DNA发生交联，随后用125毫摩尔甘氨酸将交联反应终止。沉淀下来的细胞在含有蛋白酶抑制剂的试剂盒提供的缓冲液中裂解，然后使用微球菌核酸酶在37℃下处理15分钟，使染色体发生断裂。从断裂后的染色质上取5微升的上清液作为输入对照样本（占总输入量的10%），并将其储存在-20℃下。接着在4℃下使用抗PPARγ抗体（Abcam，ab178860；兔源单克隆抗体）进行过夜免疫沉淀。蛋白–DNA复合物则使用20微升的ChIP级蛋白A/G Plus琼脂糖磁珠捕获（4℃下旋转处理1小时）。经过多次洗涤后，将结合的复合物洗脱出来，然后进行交联逆转处理（65℃下处理4小时），之后再进行DNA纯化。富集得到的DNA片段则通过SYBR Green化学方法进行qPCR定量。共聚焦显微镜实验：将骨髓间充质细胞在含有10微摩尔ATRA的条件下与SFTSV共同培养36小时。感染之后，这些细胞先经过三次PBS洗涤，然后在室温下用4%多聚甲醛的PBS溶液固定30分钟。经过多次PBS冲洗后，使用0.2%（体积比）的Triton X-100处理这些细胞15分钟，以使细胞膜通透。接着在室温下使用1%的BSA在PBS中处理这些细胞30分钟，以阻断非特异性结合位点。对于双重抗原的检测，这些样本需要在4℃下与初级抗体一起孵育过夜：鼠源多克隆抗PPARγ抗体（稀释比例为1:200）和兔源单克隆抗JUN抗体（稀释比例为1:500），这两种抗体都溶解在含有1% BSA的PBS-T（含有0.1% Tween-20）溶液中。经过三次PBST洗涤后，使用物种特异性的Alexa Fluor标记的二级抗体进行检测：488颜色的山羊抗兔IgG抗体（稀释比例为1:1,000）和594颜色的山羊抗鼠IgG抗体（稀释比例为1:1,000），这些抗体在室温下孵育1小时，同时要避免光照。核染色则是通过让这些样本在含有1微克/毫升DAPI的PBS溶液中浸泡10分钟来实现的。最后，使用抗褪色装片剂将盖玻片固定在样本上，然后使用配备有405纳米、488纳米和561纳米激光器的Andor Dragonfly 202共聚焦成像系统对样本进行成像。Z轴堆叠图像则是通过Fusion软件在相同的曝光条件下获得的。公共代谢组学数据集的收集与分析：通过液相色谱-串联质谱技术（LC–MS/MS）分析的代谢组谱数据来自患有SFTSV感染和未患有该病毒感染的病人，样本数量分别为243例和132例，详细信息可见我们之前的研究27。为了识别两组之间差异较大的代谢物，我们使用了来自‘ropls’ R软件包（v1.34）的‘opls’函数，采用正交偏最小二乘判别分析方法，相关参数设置为‘orthoI = NA, predI = 1’。此外，还使用了Wilcoxon秩和检验来评估两组之间代谢物丰度的显著差异。为了进行多重检验校正，采用了Benjamini–Hochberg方法计算FDR值。如果某种代谢物的倍变率超过0.5，且其变量重要性投影值大于2，或者FDR值小于0.001，那么就认为该代谢物具有显著的富集效应。KEGG通路富集分析则是使用ClusterProfiler R软件包（v4.12.2）中的‘enricher’函数来进行的。统计学分析与重复性：统计分析是使用Prism GraphPad软件v.8.0来进行的。在所有图表中，误差条代表平均值的标准差，P值的计算则是通过双尾Student’s t检验或ANOVA方法来完成的。为了评估两个连续变量之间的相关性，会通过线性回归计算决定系数R2。生存率的估算和可视化则是通过Kaplan–Meier方法来实现的，而不同组别之间的比较则采用log-rank检验。当双侧P值小于0.05时，就被认为是具有统计学意义的。所有的实验都进行了重复，重复次数在相应的图例中有说明。西方印迹法的代表性图像来自至少三种独立的样本制备。报告摘要：有关研究设计的更多信息，可查看本文附带的《自然》杂志报告摘要。