PMMoV RNA、crAssphage DNA和人类线粒体DNA/RNA作为基于废水的流行病学归一化标志物的比较

《Science of The Total Environment》：Comparison of PMMoV RNA, crAssphage DNA and human mitochondrial DNA/RNA as normalization markers in wastewater-based epidemiology

　　

基于废水的流行病学（Wastewater-based epidemiology, WBE）可能受益于归一化，以解释废水稀释和贡献人群的时间变化。在本研究中，研究人员比较了辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus, PMMoV）RNA、噬菌体（crAssphage）DNA靶标（CPQ056和CPPol）以及人类线粒体DNA/RNA（MT-CYB）作为国家监测环境中的归一化生物标志物。研究人员开发了一种四靶标多重逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测方法，以同时定量PMMoV RNA、CPQ056 DNA、CPPol DNA和MT-CYB DNA/RNA，并将其应用于分析来自29个污水处理厂（Wastewater Treatment Plants, WWTPs）的总共922份进水废水样本。所有标志物均高度丰富，并表现出稳健的分析性能。两个crAssphage DNA标志物高度相关，检测中未发现位点特异性或时间差异，表明在本研究中，CPQ056 DNA标志物足以可靠地定量crAssphage DNA。所有标志物对流量变化的响应相似，表明其作为稀释归一化指标的性能相当。变异性主要由WWTP特异性特征驱动，在极高流量事件期间观察到最大偏差。总体而言，各个标志物表现良好且大致相似，然而，MT-CYB DNA/RNA在不同地点和时间表现出最小的时间变异性和稳定的人当量估计值。PMMoV RNA的日间变异性最低，但表现出季节性变化。当应用于严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）RNA的归一化时，与包含流量数据的原始浓度和人均归一化相比，所有标志物均降低了变异性。总体而言，所有三种标志物均表现良好，其中MT-CYB DNA/RNA在本研究中是用于人群归一化更稳健的标志物。

基于废水的流行病学（Wastewater-based epidemiology, WBE）通过分析污水来监测人群中的病原体和化学物质，具有成本效益高、时效性强的优点。然而，污水网络中的外来水（如工业废水、地下水渗入、雨水径流）会稀释目标物，导致浓度波动，影响监测结果的准确性和可比性。目前尚无标准化的归一化方法来校正这种稀释效应。常用的方法包括使用流量数据或生物标志物，但流量数据并非总是可用或准确，且人口统计数据存在滞后性。因此，研究人员旨在直接比较三种有前景的归一化生物标志物——辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）RNA、crAssphage DNA和人类线粒体DNA/RNA（MT-CYB）——在国家监测框架下的性能，评估其作为稀释指示剂、人口规模代理变量以及病原体归一化标志物的适用性。该研究发表在《Science of The Total Environment》。

研究人员开发了一种四靶标多重逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测方法，以同时定量PMMoV RNA、crAssphage DNA（CPQ056和CPPol）和MT-CYB DNA/RNA。主要技术方法包括：1）样本采集与处理：收集来自丹麦29个污水处理厂（WWTPs）的24小时流量比例或时间比例复合样本，覆盖全国约49%的人口（约290万人），样本在4℃下运输和储存，并在24小时内处理。2）核酸提取与纯化：使用Ceres Microbiome A beads进行病毒颗粒浓缩，随后用Maxwell HT Environmental TNA kit提取总核酸。3）多重RT-qPCR检测：开发并验证了四重RT-qPCR检测方法，使用商用RNA标准品（PMMoV）和通过数字PCR（dPCR）定量的PCR产物作为标准曲线。4）数据统计分析：采用线性回归、方差分析（ANOVA）和广义加性模型（GAM）评估标志物浓度、流量、季节和站点之间的关系，并计算检测限（LoD）和定量限（LoQ）。

**3. 结果**
**3.1. 检测方法性能**
所有四种标志物的PCR效率均接近100%（范围100.5-102.8%），表明该多重qPCR检测方法能够稳健地定量所有四个靶标。实验确定的LoD分别为：MT-CYB DNA/RNA 3拷贝/反应，PMMoV RNA 2拷贝/反应，CPQ056 DNA 3拷贝/反应，CPPol DNA 4拷贝/反应，均接近理论极限，表明检测方法高度灵敏。通过分析无逆转录酶的对照样本，证实MT-CYB标志物同时包含RNA和DNA成分，而CPQ056和CPPol仅检测到DNA。

**3.2. 生物标志物数据描述**
共纳入来自29个站点的852份样本，站点服务人口范围从33,945到447,395。比较两种crAssphage标志物，CPPol DNA的浓度高于CPQ056 DNA，但两者高度相关（p<0.0001），且加入采样站点作为预测因子并未显著改善对CPPol DNA的预测（p=0.97），表明使用简并引物CPPol未检测到比CPQ056更多的位点特异性差异。因此，后续分析选择广泛使用的CPQ056 DNA代表crAssphage DNA。

**3.3. 废水中生物标志物负荷的时间稳定性**
通过分析每个站点的人均日负荷，发现PMMoV RNA的日间变异性最低（平均日变化0.0511 log₁₀（拷贝/人/天），SD=0.0736），CPQ056 DNA最高（0.0736 log₁₀（拷贝/人/天），SD=0.1020）。PMMoV RNA在夏季的浓度约为秋冬季节的3倍，CPQ056 DNA夏季浓度约为秋冬季节的1.5倍，而MT-CYB DNA/RNA在两个时期浓度相似。方差分析（ANOVA）显示，在排除雨天样本后，PMMoV RNA的夏季负荷显著高于秋冬（p<0.001），CPQ056 DNA也显著更高（p=0.033），而MT-CYB DNA/RNA无显著差异（p=0.673）。标志物负荷高度依赖于采样站点（p<0.001）。通过调整人口通勤比例或流量，这些结果未受影响。

**3.4. 使用生物标志物估算废水稀释程度**
通过分析标志物浓度与日流量之间的关系，发现平均稀释斜率（理论上为-1）略陡，范围从MT-CYB DNA/RNA的-1.36到PMMoV RNA的-1.79。在短时间窗口（8天内）内，大多数站点和标志物的稀释斜率四分位距（IQR）包含-1，且不同标志物在同一站点内斜率相似，表明存在站点特异性而非标志物特异性的稀释效应。与原始未稀释样本的PMMoV RNA定量比较，排除了PCR抑制导致稀释斜率偏离-1的可能。进一步分析发现，当流量变化较小时，稀释斜率接近-1，但当流量变化超过站点特定旱季流量的100%时，观察到稀释程度增加，表明人类源物质浓度降低程度超过了纯稀释效应。

**3.5. 使用生物标志物估算人口规模**
研究人员估算了人均当量，即每人24小时的平均生物标志物基因拷贝数，秋冬季节PMMoV RNA为4400万，MT-CYB DNA/RNA为1200万，CPQ056 DNA为1.16亿。除PMMoV RNA在夏季外，所有WWTPs的样本中每个样本的基因拷贝数/人与全国平均值的比率均接近1，但在最大和最小服务人口的集水区观察到轻微的U型趋势，表明存在高估或低估倾向。在五个最大城市连续7天采样的分析中，PMMoV RNA和MT-CYB DNA/RNA的日间变异系数（CV）最小（分别为2.37%和2.42%），跨年比较中MT-CYB DNA/RNA的差异最小（CV=14.11%）。根据通勤数据调整工作日人口规模并未进一步平滑一周内的人均生物标志物负荷。

**3.6. 生物标志物应用于SARS-CoV-2归一化**
将三种生物标志物用于归一化SARS-CoV-2负荷，并与人均归一化（使用流量和人口数据）和原始浓度进行比较。所有归一化方法显示的全国平均SARS-CoV-2废水负荷在秋冬季节增加，并于12月初达到峰值。原始SARS-CoV-2浓度与日测流量呈反比关系。与其它方法相比，PMMoV RNA归一化的SARS-CoV-2负荷在夏季和秋冬季节之间的水平变化更大。使用线性混合效应模型估算的SARS-CoV-2增长率随时间的变化趋势在三种生物标志物归一化方法中非常相似，而原始SARS-CoV-2浓度的增长率波动最大且置信区间最宽。生物标志物归一化（PMMoV RNA、MT-CYB DNA/RNA和CPQ056 DNA）的置信区间最窄（CI宽度均为~0.011）。

**4. 讨论与结论**
**总结讨论：** 本研究开发并验证了一种同时定量四种生物标志物的多重RT-qPCR检测方法。所有三种标志物（PMMoV RNA, crAssphage DNA, MT-CYB DNA/RNA）在废水中含量丰富且易于检测。PMMoV RNA表现出显著的季节性变化（夏季更高），可能源于饮食模式变化；crAssphage DNA也有轻微的季节性变化；而MT-CYB DNA/RNA则表现出最高的时间稳定性。在反映稀释效应方面，所有标志物表现相似，且站点间差异大于标志物间差异，这表明存在站点特异性因素（如工业废水、地下水渗入）影响稀释模式，而极端流量事件需谨慎解释。作为人口规模代理变量，MT-CYB DNA/RNA和CPQ056 DNA表现稳健，而PMMoV RNA需要季节性校正。在SARS-CoV-2归一化应用中，所有生物标志物归一化方法均优于原始浓度和人均归一化，提供了更一致、更稳定的信号，并有效降低了变异性。MT-CYB DNA/RNA因其卓越的时间稳定性和跨站点一致性，被认为是最稳健的归一化标志物。

**结论翻译：** 总之，所有三种测试的生物标志物作为废水稀释的预测因子表现同样良好，并且当作为归一化标志物应用时，与原始浓度相比，均显著降低了变异性，突显了其在基于废水的分析中的应用价值。在这些标志物中，MT-CYB DNA/RNA表现出最大的整体稳定性，并可能成为跨区域和时间进行人口估算的一个有吸引力的标志物。结合使用多种生物标志物可能进一步增强废水病原体归一化的稳健性并减少偏差。