结合机器学习算法的拉曼光谱技术用于区分癌细胞死亡途径：凋亡与焦亡

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Raman spectroscopy combined with machine learning algorithms for discrimination of cancer cell death pathways: Apoptosis and pyroptosis

　　摘要
背景与目的：明确药物诱导的癌细胞死亡途径对于理解药物作用机制至关重要。然而，传统的生物学实验方法存在耗时且成本高昂的缺陷。本研究旨在通过结合拉曼光谱与机器学习算法，构建能够预测癌细胞凋亡和焦亡的分类模型。

方法：选用已知可诱导不同细胞死亡途径的两种药物——顺铂和决奈达隆，用于验证所构建模型的预测性能。同时采用梯度加权类激活映射技术识别关键特征峰，并通过细胞形态观察及Western blot分析进一步验证模型预测结果。

结果：两种算法对凋亡和焦亡的预测准确率均超过90%。顺铂和决奈达隆诱导的细胞死亡途径预测结果分别集中在凋亡和焦亡上。梯度加权类激活映射可视化结果显示，凋亡与苯丙氨酸的特征峰相关，而焦亡则与酪氨酸的特征峰相关。这些结果与现有研究结论一致。

结论：研究表明，拉曼光谱结合机器学习算法可精准预测癌细胞死亡途径，且可视化技术有助于识别与这些途径相关的生物标志物，为研究药物作用机制提供可靠的技术支持。

引言
肿瘤细胞进展的关键特征之一是其能够逃避机体固有的程序性细胞死亡调控。这种逃逸会导致细胞内死亡途径紊乱，进而引发异常细胞增殖[1]，并导致多种人类疾病。抗癌药物的主要作用机制是通过激活特定的细胞死亡途径来抑制肿瘤细胞增殖甚至将其清除。因此，从分子层面明确药物诱导的具体细胞死亡途径（如凋亡和焦亡），可为细胞死亡过程建立“路线图”。这为识别药物靶点、开发新一代药物、实施联合疗法以提高疗效以及检测治疗反应的生物标志物提供了依据。

根据形态学和生化特征，细胞死亡可分为多种类型，包括凋亡、坏死[2]、焦亡、铁死亡[3]、铜死亡[4]、自噬[5]、溶酶体依赖性细胞死亡[6]以及泛死亡[7]。其中，凋亡和焦亡被视为最具代表性的细胞死亡模式。凋亡是一种程序性细胞死亡，其特征为细胞收缩、染色质凝缩、核破裂以及凋亡小体形成[8]。它主要包含两条途径：依赖线粒体的内在途径[9]以及由死亡受体调控的外在途径[10]。若凋亡持续时间过长，可能会逐渐转变为坏死，通常称为继发性坏死[11]。焦亡则是另一种受Gasdermin蛋白家族驱动的调控性细胞死亡，该蛋白家族可形成膜孔以破坏细胞结构[12]。焦亡可分为三种类型：由caspase-1介导的典型炎症途径、由caspase-4/5/11介导的非典型炎症途径，以及在caspase-3/8调控下由凋亡转化为焦亡的非典型途径[13]。目前，凋亡和焦亡通常通过Western blot、ELISA、流式细胞术以及基于组学的途径分析等传统生物学检测方法进行鉴定。尽管这些技术能够提供特定的生物标志物和分子网络[14]，但它们存在固有局限。形态学成像和基于组学的方法往往需要昂贵设备，所得结果难以量化，且无法实时阐明潜在的动态分子机制[6]。在传统的细胞死亡途径研究中，研究人员通常先用药物处理细胞，然后在不同时间点和浓度梯度下使用光学显微镜评估细胞形态。然而，形态学评估具有主观性且缺乏定量能力，难以在早期准确预测不同的细胞死亡模式[15]。包括Western blot、ELISA、流式细胞术在内的生物标志物检测方法虽能识别特定类型的细胞死亡，但常常受到假阳性或假阴性结果、脱靶效应以及细胞代偿机制的困扰。此外，这些检测方法耗时且劳动强度大，还需高水平的技术专长[14]。

拉曼光谱是一种振动光谱技术，通过观测光与物质中化学键的相互作用，可获取样品的详细化学信息[16]。目前，它已广泛应用于基础诊断、生物标志物发现、细胞分析及成像等领域。在细胞分析领域，拉曼光谱可直接检测DNA、RNA、蛋白质、脂质和胶原蛋白等生物分子的特性光谱峰。该技术具有灵敏度高、分辨率高、检测速度快且特异性强的优点[17]。拉曼光谱已被广泛用于体外研究药物与细胞的相互作用。现有研究表明，原位拉曼光谱和表面增强拉曼光谱可用于实时监测关键的分子事件，如脂质过氧化引起的膜通透性变化以及细胞色素C的释放。由此可阐明线粒体介导的铁死亡与凋亡之间的关联[18]。在肿瘤光热治疗中，拉曼光谱检测到1000?cm?1、1207?cm?1和1580?cm?1处的特征光谱增强，这些变化与苯丙氨酸的变化有关[19]。质谱分析显示，经过光热处理后[20]，细胞内游离苯丙氨酸、其衍生物以及含苯丙氨酸的二肽水平升高[21]。进一步的组学数据网络分析表明，光热治疗影响了苯丙氨酸代谢途径，并激活了由苯丙氨酸代谢物诱导的凋亡信号通路，包括线粒体凋亡途径和Fas/FasL死亡受体途径[20]。这建立了从物理刺激和光谱信号到信号通路的关联。大量文献表明，拉曼光谱可有效监测顺铂等化疗药物诱导的生化变化。例如，先前的研究已证实，无标记拉曼光谱是检测早期凋亡事件的强大工具，能够无创地捕捉顺铂引起的核酸构象变化、蛋白质二级结构重排以及脂质成分的改变[22]。此外，拉曼光谱还被用于阐明顺铂在骨肉瘤[23]和白血病细胞[24]等多种体外肿瘤模型中的抗肿瘤机制，还可通过特征振动指纹区分顺铂敏感型与顺铂耐药型癌症表型[25]。近年来，拉曼光谱与机器学习算法的结合进一步拓展了其在卵巢癌细胞亚型及顺铂耐药表型研究中的应用范围。结合拉曼光谱与机器学习的方法展现了其在精确识别细胞方面的潜力。不过需注意的是，此类研究主要集中在识别细胞的静态身份或状态以实现不同细胞类型的区分。因此，尽管取得了进展，现有的基于拉曼的技术在准确分类高度相似的细胞死亡途径方面仍存在局限。首先，绝大多数研究聚焦于凋亡[24]、[27]、[28]，而对焦亡及其与凋亡的比较研究极为有限[29]。其次，Western blot等传统鉴定方法耗时、劳动强度大且技术要求高[30]。为克服这些局限，本研究建立了一种快速的无标记拉曼鉴定平台。通过拉曼光谱直接捕获细胞的分子振动指纹，并结合机器学习算法，旨在客观区分凋亡与焦亡，从而为肿瘤治疗中细胞死亡机制的快速识别提供新的技术途径。

鉴于上述情况，本研究以凋亡和焦亡作为两种主要的程序性细胞死亡形式，重点探讨在药物诱导条件下准确区分这两种途径的难度。通过结合拉曼光谱与机器学习算法，充分利用拉曼光谱中所含的分子指纹信息及其强大的分类能力，构建了一个能够高效准确识别两种细胞死亡模式的预测模型。为测试该模型的可靠性、稳定性及泛化能力，我们选取特定细胞系作为研究对象，构建、训练并优化分类模型。之后，将训练好的模型应用于判断未知药物引起的细胞死亡模式。同时采用Grad-CAM可视化技术定位关键拉曼峰，捕捉与凋亡和焦亡密切相关的生物标志物信号。最后，通过传统的生物学实验从分子生物标志物的表达和细胞形态变化两个方面进行双重验证。结果证实了模型预测的有效性。总之，本研究将光谱检测与生物学机制分析有效结合，为研究细胞死亡机制、识别抗肿瘤药物的作用以及药物筛选过程提供了新的思路和技术方法。

实验材料
细胞系：本实验所用的胰腺癌细胞系PANC-1和肝癌细胞系Bel 7404均通过STR分型鉴定。
化学药物：实验中使用的药物及其对应的目录编号如下：决奈达隆（McClain，D833142）、顺铂（McClain，D807330）、索拉非尼（MCE，HY-10201）、奥沙利铂（MCE，HY-17371）。
所用抗体及稀释比例：GSDMD（Abcam，A24059）稀释比例为1:70,000；GSDME（Abcam，A7432）稀释比例为1:1000；GAPDH。

拉曼光谱
图1(a)展示了凋亡组和焦亡组的原始拉曼光谱。实线代表每组的平均光谱，阴影区域表示相应的标准差。通过比较两组的光谱特征，可见凋亡组的拉曼特征峰更多，信号强度也高于焦亡组。这种差异可能是由于凋亡过程中细胞收缩所致。相比之下，焦亡组……

讨论
在本研究中，通过结合拉曼光谱与多种机器学习算法，构建了用于区分凋亡和焦亡的分类模型，该模型整体识别准确率良好。在后续的预测分析中，PLS-DA模型和CNN模型均获得了令人满意的预测结果，准确率均超过90%。后续的生物学实验进一步验证了这些预测的合理性和可靠性。与……相比……

结论
为探索拉曼光谱在预测细胞死亡途径方面的可行性，本研究利用机器学习算法建立了分类模型。PLS-DA模型和CNN模型在区分凋亡与焦亡方面的分类准确率均超过90%。为验证模型的有效性，我们选择了死亡机制明确的DDP和机制不明的决奈达隆作为预测样本。根据PLS-DA模型和CNN模型的输出结果，DDP主要……

利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了新疆维吾尔自治区自然科学基金（项目编号2023D01C201）和新疆天山人才计划（项目编号2024TSYCLJ0022）的支持。

作者：温雷|李娟|李凤玲|文华艾宾|杨欣宁|侯炳谦|夏静静|张磊
单位：新疆大学生命科学与技术学院、药学院及中药研究所，中国乌鲁木齐水磨沟区华瑞街777号，邮编830017