《Talanta Open》：An amplification-free fluorescence turn-on sensing platform for in situ monitoring miRNA release from live cells
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MicroRNA（miRNA）是众多生理与病理过程的关键调控因子，在疾病诊断与治疗评估中具有重大前景。尽管已有多种定量miRNA检测方法被报道，但由于检测时间长、灵敏度不足或复杂样品基质干扰，尚无方法适用于实时监测活细胞miRNA释放。在此，研究人员报道了一种
MicroRNA（miRNA）是众多生理与病理过程的关键调控因子，在疾病诊断与治疗评估中具有重大前景。尽管已有多种定量miRNA检测方法被报道，但由于检测时间长、灵敏度不足或复杂样品基质干扰，尚无方法适用于实时监测活细胞miRNA释放。在此，研究人员报道了一种基于单链DNA（ssDNA）探针与目标miRNA杂交、并利用RNA选择性嵌入染料SYBR Green II对形成的DNA–RNA异源双链进行荧光读取的新型无扩增检测法。所提出的检测法能够定量检测目标miRNA，检测限为9.1 pM，在25至200 pM浓度范围内呈线性荧光响应（R2 = 0.999）。通过利用无标记且无扩增的设计，该平台实现了快速灵敏的定量，首次实现了活细胞miRNA释放的原位监测。将该检测法应用于miRNA-146a发现，在化疗应激下存在明显的谱系依赖性分泌谱：恶性MDA-MB-231细胞维持持续的胞外miRNA水平，而非恶性HEK-293细胞则未维持。此外，紫杉醇（paclitaxel）和伊马替尼（imatinib）处理显著抑制了MDA-MB-231细胞的miRNA-146a释放。这些结果表明，该检测法有望作为基础生物医学研究与临床诊断中实时定量miRNA分析的稳健工具。
该研究发表于《Talanta Open》。目前，miRNA作为关键的非编码RNA调控分子，其异常表达与癌症等疾病的进展密切相关，胞外miRNA（ex-miRNA）因在体液中存在且稳定，被视为极具潜力的液体活检生物标志物。然而，现有主流定量方法如定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）、微阵列（microarray）、下一代测序（next-generation sequencing, NGS）及多数电化学与荧光检测法，均需RNA提取、逆转录及酶促信号扩增等多步处理，耗时长且破坏细胞活性，无法实现活细胞miRNA动态分泌的实时、连续监测。复杂生物基质也会干扰检测灵敏度与特异性。因此，开发一种快速、灵敏、无扩增且兼容活细胞原位监测的分析方法具有重要科学与临床意义。研究人员旨在建立一种无需RNA提取与酶扩增的均相荧光传感策略，通过DNA–RNA异源双链形成激活嵌合染料实现“开启”型信号输出，从而对活细胞实时分泌miRNA进行动力学分析，并探讨化疗药物作用下癌细胞与非癌细胞的分泌差异及机制启示。
研究人员开展了基于SYBR Green II嵌入DNA–RNA异源双链的无标记、无扩增荧光开启传感平台的构建与验证研究，得出该方法检测限达9.1 pM、线性范围25–200 pM（R2=0.999），具备良好重复性与序列特异性，并能首次实现活细胞miRNA-146a分泌的原位实时监测。研究发现恶性MDA-MB-231细胞在化疗应激下持续释放miRNA-146a，而非恶性HEK-293细胞无此现象，且紫杉醇与伊马替尼显著抑制癌细胞miRNA释放，揭示不同药物通过微管稳定或激酶抑制等途径影响分泌动力学。该平台填补了现有方法只能终点分析而无法动态监测的空白，为实时定量miRNA分析及药物疗效评估提供了新工具。
作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：基于SYBR Green II嵌合染料的均相荧光光谱检测技术；利用互补单链DNA（ssDNA）探针与目标miRNA杂交形成DNA–RNA异源双双链（heteroduplex）的信号开启策略；在完全培养基中进行miRNA标准曲线校准与检测限、重复性评估的分析性能验证；对固定化MDA-MB-231细胞进行顺序加药荧光显微成像与平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）分析；以人乳腺癌细胞MDA-MB-231与人胚肾细胞HEK-293为样本队列，在活细胞培养体系中加入ssDNA探针与SYBR Green II，定时取无细胞上清通过0.22 μm过滤后进行实时荧光强度监测（激发λex 450 nm，发射λem 515 nm）；并在体系中分别加入紫杉醇与伊马替尼（各1 μM）处理，结合台盼蓝排除法确认细胞活力＞89%，以分析化疗应激下miRNA-146a分泌动力学差异。
3.1. A label-free and amplification-free fluorometric assay for miRNAs
研究人员通过对比SYBR Green II在仅含miRNA-21、仅含互补ssDNA探针、含非互补ssDNA与miRNA-21及含互补ssDNA与miRNA-21四种溶液中的荧光发射光谱，发现单独miRNA因长度短荧光极弱，单独ssDNA有中等荧光，而非互补体系无显著增强，仅在形成序列特异性DNA–RNA异源双链时荧光大幅增强。表明双链微环境更有利于染料嵌合，该无标记无扩增的荧光开启信号源于特异性杂交，可保障检测特异性与实时监测适用性。
3.2. Analytical figures of merit
研究人员在水或完全培养基中以2.5–200 pM范围配制miRNA-146a标准溶液并三次重复检测，获得荧光强度随浓度增加的发射光谱与线性校准曲线Y = 0.0343X + 1.0018（R2 = 0.999），按LOD = 3.3 × (Sy /斜率)计算得检测限为9.1 pM。对25.0 pM与100.0 pM标准液各测5次，相对标准偏差（RSD）分别为3.37%与2.52%。序列特异性验证显示非互补ssDNA无信号增强，单碱基错配可使信号降至＜5%，证明方法灵敏、重复性好且依赖精确杂交。
3.3. In situ fluorescence imaging of miRNA in fixed cancer cells
研究人员对固定化MDA-MB-231细胞依次加入SYBR Green II（1:10,000）、ssDNA探针（100 nM）与合成miRNA-146a（10 pM）并进行荧光显微成像，用ImageJ计算感兴趣区内平均荧光强度（MFI）。结果显示：仅染SYBR Green II时MFI为8.31 ± 0.91 a.u.，加探针后升至11.47 ± 0.75 a.u.，再加目标miRNA后达12.84 ± 0.96 a.u.。信号逐步增强证实ssDNA探针进入细胞质并与目标miRNA杂交形成双链供SYBR Green II嵌合，点状胞质染色符合成熟miRNA在胞质Dicer加工后的定位特征。
3.4. Real-time monitoring of miRNA secretion from live cells
研究人员在300分钟内实时监测MDA-MB-231与HEK-293细胞胞外miRNA-146a水平。阴性对照（无ssDNA探针）显示SYBR Green II与培养基成分嵌合导致前约100分钟背景荧光上升后平稳。未处理MDA-MB-231在同时存在SYBR Green II与ssDNA探针下呈线性累积释放；加1 μM紫杉醇后胞外水平明显低于基线，支持微管稳定阻碍多囊泡体（multivesicular bodies, MVBs）运输的抑制分泌机制；加1 μM伊马替尼后前30分钟迅速抑制随后平台化，提示激酶介导的快速抑制囊泡释放或加速摄取/降解；HEK-293细胞对照组无明显持续累积，显示miRNA-146a分泌具肿瘤特异性。所有条件下细胞活力＞89%。
讨论部分总结指出，现有miRNA检测多依赖终点分析且需破坏样本，无法捕捉活细胞动态分泌过程。本研究通过无扩增荧光开启策略首次实现原位实时监测，揭示恶性与非恶性细胞在化疗应激下miRNA-146a分泌谱系差异及不同药物诱导的动力学特征，为理解肿瘤免疫微环境调控（如miRNA-146a靶向TRAF6与IRAK1）及细胞出口机制（微管依赖运输等）提供动力学证据，填补了方法学空白。
结论部分翻译如下：
研究人员开发了一种新型无酶荧光“开启”传感平台，用于实时监测活细胞miRNA释放。通过利用SYBR Green II选择性嵌入目标miRNA与互补ssDNA探针形成的DNA–RNA异源双链，展示了一种快速、无标记的定量方法，避免了RNA提取与酶扩增的复杂性。该方法在荧光强度与miRNA浓度间具备稳健的线性校准关系，检测限为9.1 pM，证实该平台适于原位捕获动态细胞事件。关于化疗应激下miR-146a分泌动力的发现提供了癌细胞行为的重要新见解：恶性MDA-MB-231细胞表现持续胞外miRNA水平，而非恶性HEK-293细胞则无此现象，凸显谱系依赖性分泌谱。紫杉醇与伊马替尼显著抑制miRNA释放，进一步强调该检测法在评估药效及细胞出口机械通路（如微管依赖运输）中的效用。这些结果尤为显著，因为它们首次提供了miRNA胞吐作用的动力学而非静态视图，填补了当前依赖终点分析方法的关键空白。
