《Synthetic and Systems Biotechnology》：Systematic enzyme and cofactor engineering for efficient ursolic acid biosynthesis in Yarrowia lipolytica
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熊果酸（ursolic acid，UA）是一种具有药用价值的五环三萜（pentacyclic triterpenoid），但其微生物生产受限于低效的细胞色素P450（cytochrome P450，P450）催化以及有限的辅因子可用性。研究人员通过整合酶工程、
熊果酸（ursolic acid，UA）是一种具有药用价值的五环三萜（pentacyclic triterpenoid），但其微生物生产受限于低效的细胞色素P450（cytochrome P450，P450）催化以及有限的辅因子可用性。研究人员通过整合酶工程、辅因子优化和代谢通量平衡，构建了一个高效产α-香树脂醇（α-amyrin）的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）底盘，用于UA生物合成。对异源植物来源细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases）的筛选表明，来自油橄榄（Olea europaea）的CYP716A48是在Y. lipolytica中最有效的α-香树脂醇氧化酶。利用优化的柔性连接肽将OeCYP716A48与其氧化还原伴侣AtCPR1融合，增强了分子内电子传递，并显著提高了UA滴度。OeCYP716A48D114Q/L211F变体扩大了底物进入通道并提高了催化效率，使UA产量提高了5倍。为支持高水平的OeCYP716A48活性，研究人员系统性提高了胞内黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）、血红素（heme）和铁（iron）的可用性，从而使UA产量提高了14.4倍。在rDNA位点对CrMAS、OeCYP716A48D114Q/L211F和AtCPR1进行多拷贝整合，进一步平衡了途径通量。在5 L补料分批发酵（fed-batch fermentation）中，工程菌株生产了813 ± 24 mg/L的UA，代表了迄今为止Y. lipolytica中报道的最高滴度。该研究建立了一种可扩展且具有广泛适用性的工程策略，用于克服细胞色素P450限制，并实现酵母中三萜高效生物合成。
该研究发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》，聚焦于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中熊果酸（ursolic acid，UA）异源生物合成效率受限的问题，核心瓶颈在于植物来源细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，P450）催化效率低、电子传递效率不足，以及FAD、血红素（heme）和铁等关键辅因子供给受限。UA作为一种具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、降糖和保肝等多种药理活性的五环三萜，在医药和营养保健领域具有重要价值，同时也是其他高值三萜分子的前体骨架。传统植物提取途径存在产率低、能耗高、季节波动明显和难以规模化等问题，因此发展可持续的微生物细胞工厂具有显著必要性。虽然酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中已有较高UA产量报道，但解脂耶氏酵母因其富油特性、乙酰辅酶A（acetyl-CoA）供给充足、甲羟戊酸（mevalonate）途径通量较强、代谢灵活且具有GRAS属性，被认为是更适合三萜生物制造的重要底盘。然而该宿主中的UA合成仍长期受限于末端P450氧化步骤，因此需要从酶分子结构、电子传递、辅因子供给和路径通量多层面协同优化。
围绕上述问题，研究人员以一株高产α-香树脂醇的工程化Y. lipolytica菌株为起始底盘，系统开展了UA生物合成强化研究。研究首先筛选多种植物来源CYP716A家族酶，确定油橄榄来源OeCYP716A48为最优的α-香树脂醇C-28氧化酶；随后通过P450与细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）融合表达优化电子传递；进一步结合序列比对、分子对接和底物通道分析，对OeCYP716A48进行结构指导突变改造，获得活性显著提高的双突变体OeCYP716A48D114Q/L211F；在此基础上，系统增强核黄素-FAD合成途径、血红素合成途径及高亲和铁摄取系统，以提升P450全酶活性；最后通过rDNA位点多拷贝整合关键模块，实现代谢通量再平衡与前体高效转化。研究最终在5 L补料分批发酵中实现813 ± 24 mg/L UA产量，为Y. lipolytica中迄今最高报道值，证明系统性酶工程与辅因子工程能够有效突破P450依赖型三萜合成的限制。
本研究的重要意义在于，提出并验证了一条针对植物P450在异源微生物中“低活性、低偶联、低辅因子供给”难题的系统解决路径。该策略并非单一提升前体供给，而是明确指出在高α-香树脂醇背景下，限制UA生成的关键不在于前体不足，而在于末端氧化反应体系本身。研究结果不仅提升了UA产量，也为其他来源于2,3-氧化鲨烯（2,3-oxidosqualene）的三萜天然产物合成提供了可推广的工程范式，对构建高效、可扩展的酵母天然产物制造平台具有方法学价值。
在技术方法上，研究主要采用以下策略：以高产α-香树脂醇的Y. lipolytica PO1f衍生菌株为宿主，构建并筛选多种植物CYP716A与AtCPR1共表达菌株；利用AlphaFold预测结构、AutoDock Vina分子对接和CAVER通道分析开展结构指导蛋白工程；通过丙氨酸扫描、位点饱和突变和双突变组合筛选高活性酶变体；通过过表达RIB1/RIB2/RIB3/FMN1/FAD1、HEM2/HEM3/HEM12及FTR1/FET3/FRE1，并敲除HMX1，系统强化辅因子与金属稳态；通过rDNA位点多拷贝整合放大CrMAS、OeCYP716A48D114Q/L211F和AtCPR1模块；利用摇瓶和5 L补料分批发酵评估产物积累，并通过GC–MS和HPLC进行定量分析。
3.1. 异源P450候选酶筛选用于熊果酸生产
研究人员首先在可于摇瓶条件下积累197 ± 6 mg/L α-香树脂醇的底盘菌株YU-0中，分别导入4种植物来源P450单加氧酶MtCYP716A12、CrCYP716AL1、CaCYP716A83和OeCYP716A48，并与AtCPR1共表达，构建YU-1至YU-4菌株。经HPLC–UV和LC–Q-TOF/MS确认，所有工程菌株均实现了UA合成。其中YU-4表现最佳，UA产量为13 ± 1 mg/L，同时α-香树脂醇下降至175 ± 7 mg/L，表明OeCYP716A48在Y. lipolytica中具有最高的α-香树脂醇氧化效率，因此被选作后续优化对象。该结果说明，尽管不同CYP716A家族成员均可催化该步骤，但酶源差异显著影响异源宿主中的功能表现。
随后，研究人员构建了OeCYP716A48与AtCPR1融合表达体系，通过不同长度和柔性的连接肽优化两者空间构型，以增强电子传递。结果显示，不同连接肽对UA产量影响显著，其中柔性连接肽（GGGGS）
2效果最佳，使菌株YU-6的UA滴度提高至25 ± 2 mg/L，较未融合的YU-4提高约92%，α-香树脂醇降至147 ± 4 mg/L。该结果表明，P450与CPR之间的空间组织形式直接影响催化偶联效率，但融合优化后UA仍处于较低水平，提示酶本身的结构约束仍是重要限制因素。
3.2. OeCYP716A48工程化提升熊果酸生物合成
为进一步提高OeCYP716A48催化性能，研究人员对CYP716A同源序列进行多序列比对，并结合α-香树脂醇分子对接分析活性口袋。结果显示，血红素结合相关核心区域高度保守，而底物识别位点（substrate recognition sites，SRSs）及表面暴露区变异度较高。对接结果定位出A107、W108、W109、V113、D114、F117、S120、T123、S124、S125、E128、L211、D281、K282、G285、L286、V288、G289和R424等位点参与底物周围环境构建。综合保守性与结构信息，研究人员将中等保守的D114、S120、T123和L211视为潜在改造靶点。
通过丙氨酸扫描，D114A和L211A表现最优，UA产量分别达到27 ± 2 mg/L和28 ± 2 mg/L，均较野生型提高约2倍以上，说明这两个位点对酶活性调控尤为关键。进一步的位点饱和突变结果显示，D114Q和L211F分别使UA产量升至45 ± 3 mg/L和37 ± 2 mg/L。将两种有益突变组合后，双突变体D114Q/L211F使UA达到66 ± 3 mg/L，较野生型提升5倍，且α-香树脂醇降至109 ± 3 mg/L。结构通道分析表明，该双突变体的底物通道瓶颈半径由1.12 ?增至1.52 ?，通道长度由18.37 ?缩短至16.87 ?，throughput由0.71升至0.76，cost由0.33降至0.27，说明底物进入活性中心的空间障碍和能量障碍均得到缓解。该部分结果明确证明，改善底物进入通道几何特征是提升植物P450异源催化效率的有效策略。
3.3. FAD生物合成途径工程提高OeCYP716A48活性
在酶结构优化后，研究人员进一步考察电子传递辅因子限制。由于CPR介导的电子传递依赖黄素类辅因子，研究人员系统过表达内源核黄素-FAD生物合成途径相关基因RIB1、RIB2、RIB3、FMN1和FAD1。结果显示，仅过表达RIB1即可将UA提升至75 ± 2 mg/L，表明黄素辅因子供给已成为限制因素。继续共表达RIB2和RIB3后，UA进一步提高至93 ± 3 mg/L，同时α-香树脂醇积累继续下降，说明底物向产物的转化更加充分。最后加入FMN1和FAD1过表达后，UA达到110 ± 4 mg/L。该部分结果说明，在P450结构和底物进入效率改善后，胞内FAD供给不足会成为新的次级瓶颈，而系统强化核黄素至FAD的转化通路能够有效提高CPR驱动的电子转移能力。
3.4. 优化血红素供给与铁摄取系统以提高OeCYP716A48活性
由于P450活性中心依赖血红素作为辅基，研究人员接着对血红素生物合成途径进行强化。依次过表达HEM2、HEM3和HEM12后，UA产量分别提高至120 ± 4 mg/L、132 ± 4 mg/L和145 ± 4 mg/L，表明四吡咯（tetrapyrrole）代谢通量增强有助于提升P450全酶形成。进一步敲除血红素降解相关基因HMX1后，UA增至153 ± 5 mg/L，提示减少血红素分解可提高胞内血红素保留量，进而增强OeCYP716A48催化能力。
考虑到血红素形成还依赖铁供给，研究人员进一步改造高亲和铁摄取系统。依次过表达FTR1、FET3和FRE1后，UA产量从153 ± 5 mg/L继续升高至166 ± 5 mg/L、178 ± 5 mg/L和187 ± 6 mg/L。该结果说明，铁跨膜转运与胞外Fe
3+还原能力共同影响胞内铁稳态，从而影响血红素形成与P450活性。由此可见，P450功能优化不仅依赖酶本体和电子供体，也受制于金属离子代谢与辅基装配效率。
3.5. 5 L生物反应器补料分批发酵
在解决催化与辅因子限制后，研究人员进一步通过代谢通量放大提高最终产量。研究在YU-24菌株中于rDNA位点多拷贝整合CrMAS、OeCYP716A48D114Q/L211F和AtCPR1，经筛选获得最优菌株YU-25。该菌株摇瓶中UA产量达到205 ± 7 mg/L，且已检测不到α-香树脂醇积累，表明前体向目标产物的转化已基本实现高效耦联。随后在5 L生物反应器中进行补料分批发酵，UA在168 h达到最高，为813 ± 24 mg/L，总得率约为3.1 mg/g葡萄糖，平均体积生产速率为4.8 mg/L/h，即116.2 mg/L/day。该结果验证了多层级工程策略在放大发酵条件下的有效性，也确立了该体系在Y. lipolytica中的当前最高UA生产水平。
讨论部分指出，本研究从高α-香树脂醇底盘出发，明确了UA合成的主导瓶颈是末端P450依赖氧化步骤，而非前体供给不足。OeCYP716A48筛选、P450–CPR融合、结构指导突变、FAD增强、血红素通路优化和铁摄取强化，构成了一个逐级解除限制的系统工程框架。研究结果表明，植物P450在微生物细胞工厂中的低效表现主要由底物可达性不足、电子传递受限、辅因子供给不足和血红素形成受限共同造成。通过协调优化酶结构、电子转移、辅因子代谢、辅基生物合成和金属稳态，可以显著提高P450依赖型天然产物合成效率。多拷贝整合则进一步实现了上游α-香树脂醇形成与下游氧化反应的通量匹配，减少中间体堆积。
研究结论部分可译为：
本研究通过整合酶工程、途径平衡和辅因子优化，建立了解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）高效微生物生产熊果酸（UA）的平台。通过系统解决细胞色素P450依赖氧化这一主要瓶颈，研究人员确定OeCYP716A48是最有效的C-28氧化酶。结构指导工程改造与CPR融合优化显著提高了催化效率和底物转化能力。核黄素-FAD途径强化提升了电子传递能力，而血红素生物合成途径及高亲和铁摄取系统的工程化则证明四吡咯通量和铁可用性对功能性P450活性至关重要。优化模块的多拷贝整合实现了α-香树脂醇供给与下游氧化之间的高效耦联，消除了前体积累，并维持了通向UA的稳定代谢通量。上述组合策略在补料分批发酵中实现了813 ± 24 mg/L UA产量，为Y. lipolytica中已报道的最高水平，证实高效三萜生物合成需要对酶活性、辅因子供给和血红素形成进行协同优化。该研究为改良细胞色素P450依赖型通路提供了可推广的框架，并可扩展至其他来源于氧化鲨烯的三萜化合物，从而支持高值天然产物的可规模化、可持续微生物制造。
