综述：工程化非传统酵母生产羧酸：进展与展望

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering nonconventional yeasts to produce carboxylic acids: Advances and Prospects

　　

由于羧基（carboxyl group）的多功能性，羧酸（carboxylic acids）可作为生物基单体用于高附加值工业产品，具有巨大的市场需求。近年来，利用非传统酵母（nonconventional yeasts）从可再生原料中生产羧酸（carboxylic acids）的代谢工程（metabolic engineering）显示出越来越大的前景。在本综述中，研究人员首先总结了非传统酵母（nonconventional yeasts）（例如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、热带假丝酵母（Candida tropicalis））的特点，然后聚焦于合成单羧酸（monocarboxylic acids）、二羧酸（dicarboxylic acids）和三羧酸（tricarboxylic acids）的代谢工程（metabolic engineering）策略。最后，从有前景的底盘细胞（chassis cells）和工艺开发的角度展望了低成本、绿色和大规模生物制造（biomanufacturing）羧酸（carboxylic acids）的发展趋势。本综述也可为其他生物基产品（biobased products）的绿色制造（green manufacturing）提供参考。

1. Introduction
羧酸（carboxylic acids）是含有一个或多个羧基官能团的有机化合物，由于溶解性、反应性和pH缓冲效应的多样性，广泛用作食品添加剂和精细化工中间体。本综述讨论的羧酸限于脂肪族羧酸，根据羧基官能团数量分为单羧酸（monocarboxylic acids，如乳酸）、二羧酸（dicarboxylic acids，如中长链二元酸）和三羧酸（tricarboxylic acids，如柠檬酸）。作为富氧单体，羧酸可自身或与其他分子聚合形成聚合物，例如乳酸聚合成聚乳酸（PLA），中长链二元酸用于合成聚酰胺材料，柠檬酸用于生物基聚合物生产。目前化学合成羧酸需要苛刻反应条件，而生物合成因其温和条件、无有毒原料和昂贵催化剂、低化石能源依赖而受到关注。原核微生物如大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）对低pH适应性差，而真核微生物如酵母（yeast）偏好酸性条件，具有内在的羧酸生产能力。非传统酵母（nonconventional yeasts）由于底物谱广、耐酸性强、物质转化效率高，广泛应用于羧酸生产。随着代谢工程（metabolic engineering）和合成生物学（synthetic biology）的发展，理性改造的非传统酵母逐渐成为潜在细胞工厂。

2. A brief overview of common nonconventional yeasts
酵母是单细胞真核生物，因耐受低pH（通常低于5）而广泛用作羧酸生产的底盘菌株。非传统酵母通常指除酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）以外的酵母，多数为Crabtree阴性，在有氧条件下即使高葡萄糖浓度也不产生乙醇发酵。非传统酵母能利用多种替代碳源。例如，毕赤酵母（Pichia pastoris）和汉逊酵母（Hansenula polymorpha）是甲基营养型酵母，可利用甲醇作为唯一碳源，通过木酮糖-5-磷酸（Xu5P）循环提供中间体和还原力（NADPH）。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有发达的过氧化物酶体、强还原力供应和广泛碳源利用能力，尤其能利用长链脂肪酸和甘油三酯，自然积累脂质约占干重（DCW）的68%。热带假丝酵母（Candida tropicalis）等能氧化正构烷烃，是工业生产中长链二元酸的常见底盘。乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）可利用乳糖，马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）生长快、耐高温、能发酵多种糖。作为第二代生物炼制原料，木质纤维素水解产物中的抑制剂（呋喃衍生物）限制了生物转化。圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）因对抑制剂耐受而受到关注，其中圆红冬孢酵母是产油酵母，能同时同化乙酸和木糖；东方伊萨酵母可在pH 2.0下生长，显著降低微生物污染风险。

3. Research progress on metabolic engineering for carboxylic acid synthesis by nonconventional yeasts
本节总结了代表性单羧酸（乳酸、3-羟基丙酸、乙醇酸）、二羧酸（四碳二羧酸、中长链二羧酸）和三羧酸（柠檬酸、异柠檬酸）在非传统酵母中的合成途径及代谢工程研究进展。

3.1. Monocarboxylic acids
3.1.1. Lactic acid
乳酸是合成聚乳酸（PLA）的单体，具有D和L异构体。微生物发酵中，乳酸由乳酸脱氢酶（LDH）催化丙酮酸生成。为提高乳酸积累，主要策略包括异源表达LDH（如来自瑞士乳杆菌的L-LDH），阻断丙酮酸旁路代谢（如敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC1），以及异源表达羧酸转运蛋白（如ScJEN1）促进分泌。在甲醇利用方面，研究人员通过改造多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）的关键基因表达、增强细胞活力、修饰辅因子稳态和线粒体区室化，实现从甲醇生产乳酸。引入代谢物损伤修复基因可提高乳酸产量。非传统酵母因内在耐酸性和广底物谱，成为有前景的乳酸生产底盘。

3.1.2. 3-Hydroxypropionic acid
3-羟基丙酸（3-HP）是含羟基和羧基的三碳有机酸，可生产可降解塑料聚（3-羟基丙酸酯）（P3HP）。非传统酵母生产3-HP的主要途径是丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）途径，将丙二酰辅酶A还原为丙二酸半醛，再还原为3-HP。常见的代谢工程策略包括增加前体乙酰辅酶A（acetyl-CoA）供应、增强辅因子NADPH供应、提高乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性以精确控制丙二酰辅酶A合成。抑制脂质合成途径可增强3-HP产量。此外，β-丙氨酸途径也用于3-HP合成，需异源表达高活性天冬氨酸脱羧酶，平衡能量和辅因子供应，克服中间代谢物丙二酸半醛的毒性。非传统酵母的固有耐酸性有利于3-HP生产，且两种途径均不依赖B₁₂。

3.1.3. Glycolic acid
乙醇酸是含两个碳原子的α-羟基酸，可聚合为聚乙醇酸（PGA），用于手术缝线和一次性医疗设备。乙醇酸通常由乙醇酸还原酶催化其直接前体乙醛酸生成。生产乙醇酸的非传统酵母包括解脂耶氏酵母、Pichia naganishii、乳酸克鲁维酵母和Scheffersomyces stipitis。研究人员通过重新定向乙醛酸循环，在乳酸克鲁维酵母中表达高亲和力乙醛酸还原酶并敲除异柠檬酸脱氢酶和苹果酸合酶，实现乙醇酸积累。另一种途径是乙二醇的生物转化，通过共供料策略利用乙二醇和乙酸，在解脂耶氏酵母中提高乙醇酸产量。

3.2. Dicarboxylic acids
3.2.1. Four-carbon dicarboxylic acids: succinic acid, fumaric acid and malic acid
四碳二羧酸包括琥珀酸、富马酸和苹果酸，广泛用于食品、医药和纺织工业。合成途径包括：（1）还原性三羧酸（TCA）循环途径，利用丙酮酸羧化形成的草酰乙酸为前体，经苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸还原酶顺序生成苹果酸、富马酸和琥珀酸，该途径位于胞质，无碳损失，转化率高；（2）氧化性TCA循环，位于线粒体，乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合进入TCA循环产生琥珀酸，再经琥珀酸脱氢酶和富马酸酶转化为富马酸和苹果酸，效率较低；（3）乙醛酸支路，异柠檬酸分解为琥珀酸和乙醛酸，乙醛酸与乙酰辅酶A缩合形成苹果酸，反应简单，有发展潜力。

琥珀酸（SA）是TCA循环关键中间体。解脂耶氏酵母因高TCA循环通量和天然耐酸性可高效生产琥珀酸。氧化性TCA循环是常见途径，通过敲除琥珀酸脱氢酶亚基基因并表达耐受性基因，可提高产量。重构线粒体还原性TCA循环可解决胞质NADH限制问题。表达谷胱甘肽合成酶可提高对呋喃醛和有毒水解液的耐受性。构建非经典还原性TCA（Nc-rTCA）途径，用天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸氨裂合酶和谷氨酸脱氢酶级联反应替代草酰乙酸到富马酸步骤，可减少苹果酸形成，实现高产量和高得率。除解脂耶氏酵母外，东方伊萨酵母和马克斯克鲁维酵母也用于琥珀酸生产，通过解区室化线粒体代谢或利用耐热性降低冷却成本。

富马酸（FA）生产中，通过DNA支架引导系统调控丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶表达，并调节辅因子平衡，可提高产量。对于木糖利用，引入米根霉还原性途径并敲除天然富马酸酶基因，异源表达富马酸转运蛋白，可实现富马酸积累。

苹果酸（MA）合成中，在毕赤酵母中重构还原性TCA途径，过表达丙酮酸羧化酶和胞质苹果酸脱氢酶，可生产苹果酸。在耐酸酵母Pichia kudriavzevii中，通过构建还原性TCA途径、失活苹果酸酶、过表达可溶性吡啶核苷酸转氢酶以增强NADH供应，实现高产量L-苹果酸生产，发酵液最终pH约3.10，减少了中和剂用量。

3.2.2. Medium and long chain dicarboxylic acids
中长链二元酸一般含6个以上碳原子，可与戊二胺缩合合成生物基聚酰胺材料。工业生产主要利用末端氧化型非传统酵母如热带假丝酵母和Candida viswanathii，通过氧化石油基正构烷烃的两端甲基生成二元酸。合成途径中，正构烷烃进入细胞后经细胞色素P450酶系统（CYP和CPR）催化α-氧化生成脂肪醇，再经脂肪醇氧化酶（FAO）或脂肪醇脱氢酶（ADH）和脂肪醛脱氢酶（FALDH）生成脂肪酸，再经ω-氧化生成相同碳数的二元酸，随后分泌到胞外。常见代谢工程策略包括过表达CYP和CPR构建高效α,ω-氧化途径，阻断或减弱β-氧化，增强NADPH供应，增加脂肪酸前体供应，改造羧酸转运蛋白，以及基因组规模代谢网络模拟挖掘靶点。例如，在C. viswanathii中设计split CRISPR系统，整合多个基因，实现十二烷二酸产量224 g/L。但石油资源枯竭使该模式不可持续，利用葡萄糖和甘油等常规发酵原料合成中长链二元酸尚处于实验室研究阶段。

3.3. Tricarboxylic acids
3.3.1. Citric acid
柠檬酸（CA）含三个羧基，可添加到生物基塑料中改善性能。合成途径中，丙酮酸经丙酮酸脱氢酶复合体脱羧形成乙酰辅酶A，与草酰乙酸在柠檬酸合酶作用下缩合生成柠檬酸，这是TCA循环的入口反应。柠檬酸溢出通常由氮限制、高C/N比、特定氧和pH条件驱动。生产柠檬酸的非传统酵母主要是解脂耶氏酵母和假丝酵母属某些种。通过过表达丙酮酸羧化酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶可增强甘油同化，提高柠檬酸产量。鉴定柠檬酸转运蛋白YlYhm2p，并共表达腺苷酸脱氨酶（YlAMPD）和YlYHM2，可促进柠檬酸分泌。对于扩大底物谱，共过表达TCA循环相关基因、葡萄糖转运蛋白，下调脂质合成途径，并删除线粒体异柠檬酸转运蛋白，可从玉米秸秆水解液生产柠檬酸。

3.3.2. Isocitric acid
异柠檬酸（ICA）是医药和化学工业中有前景的构建块，具有四个异构体，化学方法产生复杂混合物，利用微生物酶的特异性可制备高光学纯度异柠檬酸。异柠檬酸由柠檬酸经顺乌头酸中间体在乌头酸酶催化下异构化生成。生产异柠檬酸的非传统酵母主要是解脂耶氏酵母。通过过表达乌头酸酶（ACO）基因可提高异柠檬酸比例。系统性研究表明，线粒体琥珀酸-富马酸载体YlSfc1调节异柠檬酸从线粒体流出，过表达YlSFC1可显著增加异柠檬酸产量，而柠檬酸线粒体载体YlYHM2是葡萄糖代谢中主要的柠檬酸转运蛋白。通过协调共表达YlSFC1和YlAMPD并失活YlYHM2，结合葡萄糖脉冲补料，异柠檬酸产量可达136.7 g/L，选择性88.1%。线粒体转运工程可作为调节柠檬酸/异柠檬酸积累比的有效策略。

4. Future prospects for improving the production of carboxylic acids by nonconventional yeasts
非传统酵母广泛用于羧酸生产，但生长缓慢且产量需提高。可从构建优质底盘细胞和工艺开发两方面开展工作。

4.1. Construction of dominant chassis cells
非传统酵母的基因工程存在合成生物学元件缺乏、基因编辑精度低、遗传背景不清等问题。合成生物学进展提供解决方案：首先，需持续挖掘和鉴定新元件（如启动子、终止子），开发生物传感器实现精细调控。例如，解脂耶氏酵母的终止子研究仍有限。CRISPR/Cas9基因编辑技术虽已应用，但效率低，尤其是大片段整合。通过系统性工程化DNA修复机制，可将非同源末端连接（NHEJ）优势型转变为同源重组（HR）优势型。诱导型过表达HR相关基因可提高编辑效率，且不影响细胞生长。其次，合成生物学克服了某些酵母只能高效合成特定羧酸的局限，实现了优势途径的跨底盘转移。例如，利用马克斯克鲁维酵母的快速生长和耐热性，通过分析关键酶催化机制和代谢网络调控，可将相关元件转移到其他非传统酵母。AI辅助的拷贝数优化和模块化组装技术（如Golden Gate组装）可加速构建。基因组规模代谢模型（GEM）整合基因组注释与胞内反应网络，可预测代谢工程靶点。第三，进一步提高对非粮底物和羧酸的耐受性。适应性实验室进化（ALE）是获得所需性状的有效方法，结合高通量筛选和多组学分析可阐明耐受机制。共培养系统通过分工合作减轻代谢负担，但需准确分析微生物群落相互作用关系。

4.2. Process development
获得优良菌株后，工艺开发对获得目标羧酸产品至关重要，包括发酵放大和下游分离提取。目前实验室研究多使用昂贵原料，工业规模需使用低成本大宗原料。发酵放大是非线性的，需确保不同规模反应器中状态变量一致。工业规模发酵中，工程微生物的遗传异质性可能更明显，导致生产力下降。通过计算机辅助发酵过程优化和放大系统，实现智能控制与生物合成途径增强的深度融合，可充分挖掘底盘微生物的生产潜力。下游分离提取是影响生产成本的关键步骤，钙盐沉淀法产生大量废水。开发新型分离提取方法实现同步发酵和回收，可减少中和剂使用、简化分离步骤并提高产量，同时避免羧酸对细胞的不可逆损伤，发挥非传统酵母底盘细胞的生产潜力。

5. Conclusions
本综述首先总结了常见非传统酵母底盘细胞的优势，然后总结了单羧酸、二羧酸和三羧酸生产的具体底盘细胞类型、合成途径及相应代谢工程策略，最后从优质底盘细胞和工艺开发方面展望了进一步提高非传统酵母生产羧酸的研究方向。随着合成生物学和人工智能的发展，基于多维调控元件挖掘、基因设计和高通量筛选的工业菌株构建与高效选育技术将受到广泛关注。通过开发高效智能发酵过程优化策略结合新型羧酸分离纯化技术，非传统酵母生产羧酸的经济可行性将不断提高，从而建立大规模绿色生产体系。这些策略还可进一步推广到其他生物基产品的低成本绿色制造。