《Talanta》：CRISPR-responsive hybrid MOF assembling assay for rapid electrochemical detection of domoic acid
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摘要多毛藻酸是一种强效的神经毒素，对食品安全和公众健康构成严重威胁。传统的检测方法往往难以在灵敏度与实用性之间取得平衡。为解决这一问题，我们开发了一种基于CRISPR响应型混合金属有机框架组装测定的电化学生物传感器。该平台采用一种新的负反馈机制，即多毛藻酸适配体本身可作为CRIS
摘要
多毛藻酸是一种强效的神经毒素，对食品安全和公众健康构成严重威胁。传统的检测方法往往难以在灵敏度与实用性之间取得平衡。为解决这一问题，我们开发了一种基于CRISPR响应型混合金属有机框架组装测定的电化学生物传感器。该平台采用一种新的负反馈机制，即多毛藻酸适配体本身可作为CRISPR/Cas12a的激活剂。目标物结合后会抑制Cas12a的切割活性，从而保护信号报告分子不被切割，实现信号的显著放大。该系统通过将滚环扩增产生的DNA纳米线作为磁珠上的支架，以及负载有大量亚甲蓝分子的UiO-66 MOF作为高效信号标签，实现了双重信号放大。这种协同策略有效提升了信号响应度，同时降低了背景噪声。当与便携式纸基电极结合用于差分脉冲伏安法检测时，该生物传感器能够以极低的检测限实现高灵敏度的多毛藻酸检测。此外，通过简单的适配体替换，它还能在复杂基质中检测石房蛤毒素，展现出强大的通用性和特异性，体现了其模块化设计的优势。这项工作不仅为现场多毛藻酸监测提供了可靠实用的解决方案，还构建了一个多功能、高性能的生物传感平台，有望用于多种危险物质的即时检测。
引言
多毛藻酸是一种由伪尼茨希亚属和尼茨希亚属海洋微藻产生的强效神经毒性氨基酸[1]，它是导致记忆丧失型贝类中毒的主要致病因子。这种毒素通过受污染的贝类（如贻贝和牡蛎）进入食物链，对人类健康构成严重威胁。摄入后，多毛藻酸会过度激活谷氨酸受体，导致神经元损伤或死亡。临床表现为呕吐、腹泻和永久性记忆丧失，严重病例甚至可能致命[2]。因此，建立快速、灵敏且特异的多毛藻酸检测方法对于保障食品安全和公共健康至关重要。目前，主要的检测方法包括生物测定法、仪器分析法和免疫分析法[[3], [4], [5]]。然而，这些方法存在检测时间长、成本高以及操作技术复杂等缺点。
为克服传统检测方法的诸多局限性，我们开始关注电化学生物传感器，这类传感器具有响应速度快、灵敏度高且易于微型化等优点[6,7]。由于对传感界面的高度依赖，电化学生物传感器从传统的三电极系统发展成了低成本、可丢弃且便于携带的配置。印刷电极就是在这方面备受关注的典型例子[8]。例如，陈等人利用金纳米粒子和经MXene改性的印刷电极，开发出一种集成型便携式电化学传感器，可用于实时监测血清生物标志物[9]。在印刷电极中，纸基印刷碳电极因其纸张基质的灵活性以及印刷技术的可扩展性而脱颖而出。拉马斯-阿尔迪萨纳等人利用这种电极开发出一种可批量生产的电化学纸基分析装置，无需样品预处理即可检测五种商业软饮料中的葡萄糖含量[10]。这些优势为实现真正的快速即时检测奠定了理想基础。
为了实现对微量生物分子的高灵敏度检测，通常需要有效的信号放大策略。目前，基于纳米材料的信号放大技术和基于核酸的扩增技术是两种主流且有效的方案[11,12]。一方面，新型纳米材料可以作为载体，装载大量信号分子，从而显著增强输出信号[13]。其中，金属有机框架材料因其高比表面积、可调控的孔结构以及易于功能化而受到广泛关注[14]。UiO-66在众多金属有机框架结构中尤为突出，因为它具有出色的稳定性以及较高的可修饰性。此外，其高孔隙率使得大量电化学信号分子（如亚甲蓝）能够有效负载在其中，为构建高性能信号标签提供了理想平台[15]。另一方面，基于核酸的等温扩增技术，如滚环扩增，能够在恒定温度下高效合成包含大量重复序列的长DNA链[16]。这种DNA链可充当一维纳米线，每个重复单元都可以被设计成特定的结合位点。这样就可以有序地组装纳米材料或酶等信号单元，实现级联信号放大[17]。此外，还可以通过Zr–O–P配位键将DNA修饰到UiO-66表面，利用金属有机框架结构作为信号载体，进一步提升RCA的检测性能[18]。这种组合策略为在复杂基质中现场分析微量毒素提供了有力手段。
近年来，规律间隔短回文重复序列CRISPR及其相关蛋白技术因其卓越的基因编辑能力而获得全球认可[19]。不过，它们在生物传感领域的应用潜力同样显著，尤其是其切割活性，为构建下一代高灵敏度分子诊断工具提供了强大动力[20,21]。在众多CRISPR效应蛋白中，Cas12a具有独特的优势。当其crRNA与目标DNA的激活链特异性结合后，活化的Cas12a会无差别地切割周围溶液中的单链DNA。在生物传感器领域，Cas12a的切割活性已被广泛用于构建高灵敏度的检测平台[22,23]。例如，王等人通过将RCA与CRISPR/Cas12a系统相结合，实现了尿液样本中RNA的超灵敏检测[24]。在另一项研究中，吕等人将CRISPR/Cas12a系统与适配体技术相结合，设计出以适配体互补链构成的双链结构作为Cas12a的激活链，利用其切割活性实现了对循环肿瘤细胞的精准检测[25]。这些研究充分展现了CRISPR/Cas12a系统在构建下一代生物传感器方面的巨大潜力与多样性。
在此，我们基于CRISPR响应型混合MOF组装测定法，开发了一种用于超灵敏检测多毛藻酸的电化学生物传感器。该传感器整合了适配体的高特异性识别能力、CRISPR/Cas12a的切割活性，以及RCA和MOF双重信号放大策略（见图1）。通过将CRISPR/Cas12a的精确调控机制与MOF-RCA双重放大系统深度结合，该传感器解决了传统检测方法中长期存在的特异性与灵敏度难以兼顾的问题，为电化学生物传感器的设计提供了新思路。首先，负载有亚甲蓝的UiO-66作为信号元件，通过表面修饰的DNA实现定向组装。UiO-66的高孔隙率和大表面积使其能够容纳大量电活性亚甲蓝分子，从而实现初级信号放大。随后，通过RCA在磁珠表面生成一维DNA纳米线，进而构建出信号放大元件，使得多个MOF@MB单元能够级联结合，实现二级信号放大。我们创新性地设计了“目标物-适配体-Cas12a”分子开关与MOF-RCA信号放大之间的连接机制，实现了从目标识别到信号输出的高效协同。最后，通过适配体-CRISPR调控机制，当目标多毛藻酸与适配体结合时，会释放出用于激活Cas12a的单链DNA，从而防止Cas12a被激活并切断信号元件，使UiO-66@MB探针保留在RCA产物上。随后通过差分脉冲伏安法检测亚甲蓝的电化学信号，即可实现对多毛藻酸的定量分析。通过MOF结构和RCA反应实现双重信号放大，该方法不仅能实现多毛藻酸的超灵敏和高特异性检测，还为检测其他海洋毒素提供了一种灵活有效的手段。
章节摘录
材料与试剂
本研究所使用的所有DNA核苷酸序列均由上海桑格生物技术公司合成，具体信息见表S1。多毛藻酸和石房蛤毒素的适配体序列参考了赵等人的研究[26]以及齐等人的研究[27]。重组LbCas12a（Cpf1）蛋白、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶以及脱氧核苷酸混合物（dNTP混合物，浓度为10?mM）也由上海桑格生物技术公司提供。链霉亲和素磁珠则购自上海贝赛斯生物技术公司。
纳米材料的表征
采用透射电子显微镜对UiO-66和UiO-66@MB的形态进行了表征。如图2A所示，UiO-66呈八面体结构，平均直径为200?nm[28]。经过亚甲蓝和DNA修饰后，UiO-66仍保持其八面体结构（见图2B和C）。在UiO-66@MB的元素分布图中检测到了亚甲蓝中所含的硫元素，这表明亚甲蓝已成功修饰到UiO-66上。同时，还检测到了磷元素的存在
结论
总之，本研究成功构建了一种名为CRISPR响应型混合MOF组装测定的新型电化学生物传感器。该平台巧妙地将适配体识别功能与CRISPR/Cas12a的调控功能相结合，同时采用了基于RCA生成的DNA纳米线和UiO-66 MOF信号标签的双重信号放大策略。借助便携式纸基电极系统，该生物传感器对多毛藻酸表现出极高的灵敏度（检测限为1.34?ng/mL），且在一定线性范围内
CRediT作者贡献说明
徐振飞：数据整理、正式分析、初稿撰写。顾震：资源获取、验证实验。马忠文：验证实验。胡波：项目指导、结果可视化。叶邦策：资金筹集、项目指导。徐慧英：资金筹集、方法设计、资源获取、项目指导、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了以下机构的资助：中国国家自然科学基金（编号：22374048、22134003）、中国国家重点研发计划（编号：2020YFA0908800）以及上海市科学技术委员会（编号：25HC2830200）。
Zhenfei Xu|Zhen Gu|Zhongwen Ma|Bo Hu|Bang-Ce Ye|Huiying Xu
中国华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237
