《Talanta》：A light-activated one-pot ERA/CRISPR-Cas12a assay for cost-effective dual-mode detection of HBV DNA
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摘要光激活型CRISPR-Cas系统为解决一次性核酸检测中的动力学不兼容问题提供了有效策略；然而，其实际应用仍受高昂试剂成本、缺乏适配反应缓冲液以及依赖特定仪器读数等限制。在本研究中，我们开发了一种经济高效的光控一次性ERA/CRISPR-Cas12a平台，用于快速检测乙型肝炎病
摘要
光激活型CRISPR-Cas系统为解决一次性核酸检测中的动力学不兼容问题提供了有效策略；然而，其实际应用仍受高昂试剂成本、缺乏适配反应缓冲液以及依赖特定仪器读数等限制。在本研究中，我们开发了一种经济高效的光控一次性ERA/CRISPR-Cas12a平台，用于快速检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA。通过使用NPOM封装的crRNA，在扩增过程中暂时抑制Cas12a的活性，再通过30秒的紫外线照射触发针对目标序列的切割反应。用ERA替代RPA后，该一次性检测的每反应试剂成本从约6美元降至2美元，降幅达66.7%，同时保持了相近的分析性能。此外，通过系统优化，我们建立了无PEG的统一缓冲液，使得ERA和Cas12a反应能够在密封的单管体系中高效结合。该平台可通过荧光检测和侧流检测两种方式实现双重读数，检测限为1拷贝/μL，总检测时间为30分钟。对79份血清样本的临床评估显示，荧光检测的灵敏度为100%，侧流检测的灵敏度为96.3%，与qPCR的结果高度一致（Cohen’s κ值在0.94至1.00之间）。鉴于其低成本、高灵敏度以及操作简便性，该平台有望成为集中实验室及资源有限地区快速进行HBV分子诊断的有效工具。
引言
乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球重大的健康问题，也是导致肝硬化和肝细胞癌的主要原因[1]、[2]。尽管疫苗接种计划已大幅降低了HBV的传播率，但仍有许多感染者未被诊断出来，尤其是在那些缺乏集中检测条件的资源有限地区[3]、[4]、[5]。生化检测缺乏病因特异性，而血清学检测由于存在诊断窗口期，可能无法检测出早期感染。此外，HBV抗原表位发生突变可能会影响抗体的识别能力，从而导致诊断失败和假阴性结果，而且血清学标志物对活跃的病毒复制信息提供有限的支持[6]、[7]、[8]。这些局限性凸显了直接检测HBV DNA在早期诊断、疾病管理、抗病毒治疗监测以及公共卫生监测中的重要性[9]、[10]。然而，作为临床金标准的定量实时PCR（qPCR）需要昂贵的设备、专业人员以及完善的实验室条件，这限制了其在偏远和资源匮乏地区的应用[11]、[12]。因此，迫切需要一种灵敏、准确且易于使用的HBV DNA检测方法。
基于CRISPR的核酸检测技术已成为快速、灵敏的分子诊断领域的重要替代方案[13]、[14]。尤其是Cas12和Cas13核酸酶的转切活性，能够在序列特异性识别目标后实现有效的信号放大，从而推动了DETECTR、HOLMES和SHERLOCK等检测平台的开发[15]、[16]、[17]、[18]。不过，实际应用中面临的一个主要挑战是等温扩增与CRISPR介导的信号生成在一次性检测体系中的生化不相容性问题[19]、[20]、[21]。因此，许多已报道的CRISPR检测方法仍需采用两步法、开放式管路操作，这不仅增加了污染风险，还限制了其在即时检测场景中的应用[22]、[23]、[24]。虽然物理隔离和相分离策略可以在一定程度上解决这一问题，但它们往往会增加操作复杂性，并可能影响分析性能[24]、[25]、[26]。
通过对CRISPR活性进行光化学调控，可以在不物理分离反应组分的条件下，将核酸扩增与基于CRISPR的检测在时间上分开，从而为解决这一难题提供了有效途径[27]。早期的研究使用可光裂解的互补寡核苷酸来抑制crRNA的活性，但这些系统需要额外的退火步骤以及对链比例的精确控制[28]、[29]。最近，直接在crRNA中引入光敏封装基团，为检测方法的简化与精准控制提供了新思路。其中，NPOM（6-硝基哌酮氧甲基）封装的crRNA能够有效抑制扩增过程中的目标识别，而在短暂紫外线照射后又能恢复Cas12a的活性，从而实现在密封的一次性检测体系中的光控操作[30]、[31]。
尽管取得了这些进展，但仍有若干因素阻碍着光激活型CRISPR-Cas检测技术的实际应用。首先，大多数已报道的系统都基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，而该技术较高的试剂成本以及相关的许可限制，影响了其大规模应用[32]、[33]。酶促重组酶扩增（ERA）则是一种更具成本优势的替代方案，它不仅能显著降低试剂成本，还能保持与RPA相当的扩增效率[34]、[35]。不过，ERA与光激活型CRISPR-Cas12a系统的兼容性尚未得到充分研究。其次，由于重组酶驱动的扩增与Cas12a介导的转切反应在离子强度和Mg2?浓度等生化条件上存在差异，因此建立一种通用的反应缓冲液仍然具有挑战性[5]、[36]、[37]。第三，大多数高性能CRISPR检测方法仍依赖于荧光检测仪器，这限制了其在野外及资源匮乏地区的应用[38]、[39]。因此，亟需一种集成化、价格合理且适配多种仪器的综合性一次性检测平台。
在本研究中，我们开发了一种光激活型一次性ERA/CRISPR-Cas12a平台，用于快速检测HBV DNA。通过用ERA替代RPA，该检测方法的成本显著降低，同时保持了良好的分析灵敏度。通过系统优化，我们建立了无PEG的统一缓冲液，使得ERA扩增与Cas12a转切反应能够在同一个封闭容器中进行。结合NPOM封装的crRNA实现时间控制功能，该平台还能通过荧光检测和侧流检测两种方式实现双重读数。这一方法为HBV分子诊断提供了一种实用、灵敏且成本低廉的解决方案，有望在集中实验室及资源有限地区得到广泛应用。
章节节选
试剂与材料
用于检测的HBV感染患者血清样本取自华南大学南华医院检验医学科。用于评估分析特异性的甲型肝炎病毒（HAV）、丙型肝炎病毒（HCV）、EB病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）的基因组核酸也来自同一机构。QIAamp DNA Mini试剂盒购自德国希尔德伦的QIAGEN公司。基本的酶促重组酶
光控一次性ERA/CRISPR-Cas12a平台的可行性
所设计的这种一次性平台旨在将基于ERA的目标扩增与CRISPR-Cas12a介导的信号生成集成在同一个封闭容器中，同时支持荧光检测和侧流检测两种读数方式（见图1A）。在扩增阶段，NPOM封装的crRNA会使Cas12a处于非活性状态，从而避免报告基因过早被切割。等温扩增完成后，短暂的紫外线照射（365纳米波长，30秒）可去除光敏封装基团
讨论
HBV仍然是全球慢性肝病的主要致病因素，而基于qPCR的检测方法由于其高昂的成本和复杂的实验条件，限制了其在基层地区的应用[40]、[41]。CRISPR-Cas12a检测技术结合等温扩增方法，为快速核酸检测提供了新的可能性，但由于扩增反应与转切反应需要不同的生化环境，且Cas12a的过早激活可能影响检测结果，因此实现二者在一次性检测体系中的完美整合仍然具有挑战性
结论
总之，我们开发了一种通过光化学调控实现的双模式HBV DNA检测平台，该平台结合了NPOM封装的crRNA以控制Cas12a的活性，以及专为ERA反应优化的无PEG统一缓冲液，使得等温扩增与CRISPR检测能够在单个试管中完成，同时还支持荧光检测和无仪器参与的侧流检测。该平台的检测限可达1拷贝/μL，检测效果优异
CRediT作者贡献说明
彭晓珍：研究工作、数据整理。王朗：验证工作、资源提供。周轩：初稿撰写、可视化处理、方法设计、研究工作、正式分析、数据整理、概念构建。周兰英：方法设计、研究工作。桂芳：方法设计、研究工作。李月：可视化处理、研究工作、数据整理。刘梦兆：研究工作、数据整理。邓忠良：审稿与编辑、项目监督、项目管理、资金申请
数据可用性
本研究的相关数据可在合理请求下向通讯作者获取。
关于写作过程中使用生成式AI及AI辅助技术的声明
在撰写本手稿时，仅使用了生成式AI工具来优化语言表达和语法结构。所有内容均由作者亲自审核、验证并修改，他们对最终手稿的准确性和完整性负全责。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
我们衷心感谢研究团队所有成员在整个研究过程中的大力支持与贡献。本研究得到了中国病原体与生物安全国家重点实验室资助基金（项目编号SKLPBS2437）、湖南省高校科研创新平台“肝癌新型生物分子解析与智能诊断”以及湖南省教育厅的科学研究经费支持（项目编号25A0736）。
Xuan Zhou|Lang Wang|XiaoZhen Peng|Mengzhao Liu|Yue Li|Fang Gui|Lanying Zhou|Zhongliang Deng
中国湖南省怀化市418000，湖南医药学院医学检验学院
