《Talanta》：Fluorimetric detection of leucine aminopeptidase based on copper-initiated cascade amplification
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摘要检测亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性对于诊断肝癌和肝损伤至关重要。本研究提出了一种基于荧光的新方法，通过级联催化反应实现LAP的敏感检测。以组氨酸和亮氨酸为底物合成了亮氨酸-组氨酸复合物（LeH）。值得注意的是，组氨酸能够有效抑制铜离子催化的邻苯二胺氧化为荧光性2,3-二氨基苯嗪
摘要
检测亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性对于诊断肝癌和肝损伤至关重要。本研究提出了一种基于荧光的新方法，通过级联催化反应实现LAP的敏感检测。以组氨酸和亮氨酸为底物合成了亮氨酸-组氨酸复合物（LeH）。值得注意的是，组氨酸能够有效抑制铜离子催化的邻苯二胺氧化为荧光性2,3-二氨基苯嗪（oxOPD）的反应，从而降低荧光信号强度。由于LAP会水解LeH释放出组氨酸，而组氨酸又会抑制铜离子-OPD体系的作用，因此可以通过监测水解过程中的荧光变化来定量评估LAP的活性。由于铜离子-OPD体系在测定组氨酸浓度方面表现优异，该方法能够实现极高的检测灵敏度，检测限低至0.05 U/L。此外，该策略还被成功用于检测细胞中的LAP活性。
引言
亮氨酸氨基肽酶（LAP）是一种水解酶，能够特异性地催化蛋白质和多肽N端亮氨酸残基的水解[1]、[2]、[3]。它在多种生理过程中起着重要作用，包括蛋白质代谢、更新以及细胞调控[4]、[5]、[6]。在人体肝脏、胆管上皮细胞、肾近端小管以及小肠黏膜中，LAP的活性尤为显著[7]、[8]、[9]。LAP水平的变化与肝损伤和肝细胞癌密切相关，因此检测LAP对于早期诊断肝脏疾病极为重要[10]、[11]、[12]、[13]。目前的检测方法主要致力于设计那些在与LAP反应后能产生荧光信号的底物[14]、[15]、[16]、[17]。不过，这些基于底物的方法存在一定局限性，通常只涉及一步反应，难以进一步提升检测灵敏度，因此有必要探索其他检测方法。
相比之下，邻苯二胺（OPD）和硫胺素（TH）是一种简单且可商业购买的荧光分子，成本低廉且无需合成，因此在分析检测领域被广泛使用[18]、[19]。这些分子本身不发光，但在金属离子的催化氧化作用下会发出强烈的荧光。这一反应被用于检测多种物质，包括抗坏血酸、谷胱甘肽以及组氨酸[20]、[21]、[22]。例如，铜离子催化OPD氧化产生的氧化产物oxOPD能够抑制上转换纳米粒子的荧光，从而便于检测这类光学活性物质[23]。还有研究利用铜离子修饰的UiO-66-NH?催化剂催化OPD氧化的特性，来检测神经毒剂类似物二乙基氯磷酸酯[24]。此外，铜离子-H?O?-OPD体系也被用于构建检测白介素-6的免疫分析法[25]。不过，由于OPD的水溶性相对较差，其实际应用有时会受到限制。
普鲁士蓝的一步催化反应往往会导致较低的检测灵敏度，难以检测微量物质。而级联催化则通过将多个催化步骤结合在一起，让一个反应的产物作为下一个反应的催化剂，从而形成多级放大机制，显著提升信号强度。这种方法在生物传感领域被广泛采用，用以提高检测灵敏度[26]。例如，就有研究开发出一种级联反应，先通过乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解，再通过铁掺杂碳点纳米酶催化TMB氧化，以此检测人体内的胆碱酯酶水平[27]。还有基于级联反应的莱克多巴胺检测免疫分析法，其中碱性磷酸酶首先催化L-抗坏血酸-2-磷酸水解，生成的产物再通过MnO?纳米粒子催化的Amplex Red氧化[27]。类似地，还有研究设计了另一种级联催化系统：碱性磷酸酶先催化钠L-抗坏血酸-2-磷酸水解生成抗坏血酸，抗坏血酸再将三价铁还原为二价铁，进而催化过氧化氢氧化半胱氨酸[28]。
借助级联催化的信号放大作用，本研究开发出一种用于高灵敏度检测LAP的新型荧光方法（见图1）。在该方法中，首先由组氨酸和亮氨酸合成二肽亮氨酸-组氨酸复合物（LeH）。铜离子能够催化无荧光的OPD氧化为其荧光性氧化产物OPDox，而组氨酸则能够特异性抑制铜离子的这种催化活性。在检测过程中，LAP会水解LeH释放出游离组氨酸，这些组氨酸随后会与铜离子结合，抑制铜离子催化的OPD氧化反应。这种抑制作用实际上形成了一个级联催化体系，能够放大检测信号，从而实现LAP的超灵敏定量检测。该方法已被成功应用于检测细胞中的LAP活性。
章节节选
试剂
硫酸铜、组氨酸、组胺、OPD、乙酰组氨酸、尿素、葡萄糖、胆红素以及LAP均购自上海阿拉丁试剂有限公司。亮氨酸-组氨酸复合物（LeH）则在我们实验室自行合成（见图1及补充数据）。所有试剂均为分析级，无需进一步纯化即可使用。荧光检测则是通过微孔板读仪完成的。
构建被组氨酸抑制的铜离子-OPD反应体系
为检测铜离子引发的OPD氧化反应，将20 μL浓度为0.5 mM的铜离子溶液与180 μL OPD溶液混合
组氨酸对铜离子-OPD反应的抑制作用
无荧光的OPD在经过铜离子的催化氧化后会发出强烈的黄色荧光[29]（见图1A）。如图1B所示，置于碱性环境中的铜离子-OPD混合物会在约565纳米处出现明显的荧光峰，这一特征与OPD的氧化产物oxOPD相符[30]。为了确定OPD氧化过程中氧化剂的来源，研究人员在充满空气或氮气的溶液中检测了铜离子-OPD体系的荧光强度，实验结果表明
结论
综上所述，本研究利用组氨酸能够抑制铜离子引发的OPD氧化这一特性，开发出一种用于高灵敏度检测LAP的新型荧光分析法。铜离子可以催化OPD氧化并产生荧光，但组氨酸与铜离子之间的强相互作用会抑制这种催化活性。LAP则能够催化LeH水解释放出组氨酸，而这些组氨酸又会降低铜离子-OPD溶液的荧光强度。通过检测这些荧光变化，就可以确定LAP的浓度。
CRediT作者贡献说明
田聪魁：论文撰写——审阅与编辑，资金获取。 刘宇：论文撰写——初稿撰写，项目管理，正式分析，概念构思。 党志豪：项目管理。 惠俊民：数据整理。 毕启政：数据整理。 楚晓宁：数据整理。 刘卓：数据整理
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了湖北民族大学科研项目（编号XN24028）、中国湖北省自然科学基金（2025AFD142）、湖北省教育厅科技计划项目（编号Q20231905）、湖北民族大学博士科研启动基金（编号BS24047）、湖北省科技计划项目（2024BSB001）以及中国湖北省自然科学基金（2024AFB496）的支持。
刘宇|毕启政|楚晓宁|党志豪|惠俊民|刘卓|田聪魁
中国湖北省恩施市学院路39号，湖北民族大学硒资源研究与生物应用重点实验室，邮编445000
