《Talanta》：Challenging proteomic identification of animal species in historical leather from Japanese Samurai armors
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本研究报道了来自Morigi收藏（瑞士卢加诺）的四件日本武士铠甲（16–20世纪）历史皮革的蛋白质组学分析，旨在鉴定所使用的动物物种，并深入了解历史工艺、材料选择及后来的修复实践。研究人员采用了一种结合MALDI-ToF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
本研究报道了来自Morigi收藏（瑞士卢加诺）的四件日本武士铠甲（16–20世纪）历史皮革的蛋白质组学分析，旨在鉴定所使用的动物物种，并深入了解历史工艺、材料选择及后来的修复实践。研究人员采用了一种结合MALDI-ToF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）和RPLC-ESI-MS/MS（反相液相色谱-电喷雾电离串联质谱）的自下而上蛋白质组学工作流程，应用于六份皮革微样品。初步分析显示，常规酶解对部分数据集无效，很可能是因为植物鞣剂与胶原蛋白形成了稳定的不溶性复合物，阻碍了蛋白质提取。为克服这一限制，研究人员在现代植物鞣皮革上优化了一种提取方案，在胰蛋白酶消化前使用碱性脱鞣、透析和过滤辅助样品制备（FASP）。该工作流程实现了所有六份历史标本的分类学归属，包括三份最初在常规消化下失败、仅在优化后的NaOH/FASP（氢氧化钠/过滤辅助样品制备）方案后才解决的样品。在一份来自最古老铠甲的样品中鉴定出鹿皮，这与前现代日本皮革使用的历史记载一致，而三份样品中鉴定出牛皮，另外两份鉴定出羊皮。在一件与16世纪铠甲相关的部件中出现羊皮，难以与日本动物利用的有记载历史相协调，更有可能是后来未记录的修复而非原始制造。总体而言，结果表明自下而上蛋白质组学为鞣制历史皮革的分类学鉴定提供了一种有效且微创的方法，并为研究具有文化重要性的铠甲收藏提供了一种稳健的分析策略。
**研究背景与问题**
日本武士铠甲从纯功能性战斗装备演变为象征等级、权威和审美精炼的复杂物品，尤其是在和平的江户时代（1603–1868）。这一演变伴随着材料的重要变化：早期铁板结构被更轻便的金属和皮革片层组合所取代，以适应运动和日本潮湿气候。皮革的动物来源取决于富含胶原蛋白组织的机械和化学特性。历史文献记载，刚性牛皮被用于肩甲等部件，但牛在明治时期前在日本相对罕见；江户时代佛教信仰限制肉类消费，限制了牛的使用，因此鹿是当地主要皮革来源。其他动物如狗、马、猴等也被选用。然而，尽管有丰富的文献背景，武士铠甲中皮革组件的动物起源尚未通过蛋白质组学分析直接确定。本研究旨在通过调查Morigi收藏（捐赠给瑞士卢加诺Museo delle Culture – MUSEC）的四件铠甲（跨越安土桃山、江户、昭和时期）来填补这一空白。此前研究已通过光谱和显微镜方法表征了金属线、纺织品、染料、颜料和纤维，但对皮革的动物物种鉴定仍无法通过光谱学单独解决。此外，常规酶解对部分历史样品无效，因为植物鞣剂与胶原蛋白形成稳定不溶性复合物，阻碍蛋白质提取，因此需要优化提取方案。
**研究内容与结论**
研究人员采用自下而上蛋白质组学策略，结合MALDI-ToF-MS和RPLC-ESI-MS/MS，对六份历史皮革微样品进行分析。通过优化碱性脱鞣、透析和过滤辅助样品制备（FASP）的提取方案，成功鉴定了所有样品的物种归属：最古老铠甲（Mor.1）中一份样品鉴定为鹿皮，符合前现代日本皮革使用历史；三份样品鉴定为牛皮；两份样品鉴定为羊皮。其中一份16世纪铠甲部件中的羊皮难以与历史记载协调，更可能指示后期未记录的修复而非原始制造。该研究证明自下而上蛋白质组学为鞣制历史皮革的分类学鉴定提供了一种有效且微创的方法，为研究具有文化重要性的铠甲收藏提供了稳健分析策略。论文发表在《Talanta》。
**主要技术方法**
研究人员采用自下而上蛋白质组学工作流程，结合MALDI-ToF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）和RPLC-ESI-MS/MS（反相液相色谱-电喷雾电离串联质谱）。关键方法包括：针对植物鞣制皮革优化了碱性脱鞣（50 mM NaOH，80°C，8小时）、透析（3500 Da分子量截留膜）和过滤辅助样品制备（FASP，10 kDa标称分子量截留再生纤维素膜）的预处理方案，随后进行胰蛋白酶消化。使用高分辨率RPLC-ESI(+)-ddFTMS（数据依赖性全扫描傅里叶变换质谱）和低分辨率RPLC-ESI(+)-CID-MS/MS（碰撞诱导解离串联质谱）进行肽段测序。数据通过Protein Prospector和Proteome Discoverer软件处理，并利用BLAST对候选物种（牛、水牛、马、猪、羊、山羊、鹿、狗、猴）的胶原蛋白序列进行比对。样品来自Morigi收藏的四件日本武士铠甲（瑞士卢加诺MUSEC博物馆），包括安土桃山时期（16世纪末）、江户时期（17–18世纪）和昭和时期（20世纪上半叶）的六份微样品。
**研究结果**
**3.1. SEM-EDX结果**
通过扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDX）分析，确认了样品的纤维形态，与皮革一致。未检测到铬，排除了铬鞣；检测到钙、铝、硫、铁、钠、钾、氯等元素，与历史处理（石灰、明矾、铁基化合物、食盐）兼容。该结果支持样品为皮革，并显示存在非均质无机残留物，可能反映制造和后期改变过程。
**3.2. MALDI-ToF-MS结果**
对样品进行常规酶解后MALDI-ToF-MS分析，样品1_7、4_2、4_11显示出胶原蛋白肽特征离子，但物种鉴定不充分：1_7的m/z 1180.6、2883.4、3017.5与羊、鹿、猪兼容；4_2和4_11的m/z 1192.6、2853.4可区分牛/水牛与其他物种，但无法区分两者。样品1_3a、3_5、5_4的MALDI图谱无胶原信号，推测因鞣剂干扰。通过在现代植物鞣皮革上测试四种提取方法，发现方法1（NaOH脱鞣+FASP）效果最佳，回收更多胶原肽。对样品1_3a*、3_5*、5_4*应用优化方案后，MALDI图谱显示胶原肽信号显著恢复，但诊断性m/z组合仍不明确，需进一步LC-MS分析。
**3.3. RPLC-ESI(+)-MS结果**
通过高分辨率RPLC-ESI(+)-ddFTMS对样品进行肽段测序，并结合BLAST比对进行物种归属。
- 样品1_7：鉴定出15条胶原序列，全部与鹿（Cervus canadensis或Cervus elaphus）100%匹配，而羊匹配13/15，猪匹配12/15，确认鹿皮。
- 样品4_2和4_11：分别鉴定出17和12条序列，牛（Bos taurus）匹配全部，水牛（Bubalus bubalis）分别匹配16/17和11/12；肽段TGPPGPSGISGPPGPPGPAGK（含4个脯氨酸氧化）排除水牛，确认牛皮。
- 样品1_3a*和5_4*：经优化预处理后，1_3a*鉴定出31条序列，与羊（Ovis aries）完美匹配31/31，山羊（C. hircus）匹配30/31；肽段AGEVGPPGPPGPAGEK（含2个脯氨酸氧化）区分羊与山羊，确认羊皮。5_4*同样鉴定为羊皮。
- 样品3_5*：鉴定出13条序列，全部与牛100%匹配，确认牛皮。
**讨论与结论**
研究结果总体与历史记载一致：最古老铠甲（Mor.1）中鹿皮样品符合前现代日本鹿皮使用传统；但同一铠甲中的羊皮样品（1_3a*）与历史冲突，因为明治时期前羊在日本不常见，更可能指示后期未记录的修复，而非原始制造。样品4_11（来自Mor.4的护胫甲片）被鉴定为牛皮，与护胫甲片安土桃山时期的年代矛盾，推测该部位因磨损被后期修复。研究结论强调，自下而上蛋白质组学结合优化脱鞣方案，是鉴定降解历史皮革动物物种的有效、低成本方法，为博物馆中鞣制皮革收藏品的未来研究提供了实用模板。研究结论部分原文翻译如下：
本研究首次专门采用蛋白质组学方法对历史武士铠甲中皮革插入物的动物物种进行了科学调查。通过连接历史文献和分析证据，为前现代日本的物质文化以及动物资源的管理和流通提供了新见解。基于胰蛋白酶消化的自下而上蛋白质组学工作流程被用于搜索一系列候选物种（包括牛、水牛、马、猪、羊、山羊、猴和鹿）的胶原蛋白标志肽。六份样品中三份直接归属为鹿皮或牛皮；其余三份需要针对古代鞣制皮革的靶向提取策略（基于FASP），该策略实现了胶原肽的高效回收，并归属为牛皮和羊皮。总体而言，结果澄清了一个在历史文献中广泛讨论但很少通过科学分析检验的方面，并为未来历史皮革文物的研究提供了有用的方法论框架。
