《Toxicology Reports》：Comprehensive safety assessment of novel dicholine folate vitamin
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新型维生素盐形式可在保留母体化合物生物活性的同时提供配方优势。本安全性评估评价了二胆碱(6S)-5-甲基四氢叶酸（dicholine L-5-MTHF），这是一种还原型叶酸来源，旨在递送具有比现有还原型叶酸盐更高水溶性和稳定性的生物活性L-5-MTHF。由于L
新型维生素盐形式可在保留母体化合物生物活性的同时提供配方优势。本安全性评估评价了二胆碱(6S)-5-甲基四氢叶酸（dicholine L-5-MTHF），这是一种还原型叶酸来源，旨在递送具有比现有还原型叶酸盐更高水溶性和稳定性的生物活性L-5-MTHF。由于L-5-MTHF盐解离产生L-5-MTHF及其各自的反离子，研究人员采用整合现有L-5-MTHF盐已发表数据与胆碱暴露信息的权重证据法评估二胆碱L-5-MTHF的安全性。研究人员对二胆碱L-5-MTHF进行的包括细菌回复突变、染色体畸变和哺乳动物微核试验在内的标准体外致突变性组合试验均为阴性，且与其他还原型叶酸来源的更广泛致突变性特征一致。此外，研究人员对钙和钠L-5-MTHF盐进行的大鼠亚慢性口服毒性研究在最高测试剂量下未发现不良影响，且L-5-MTHF盐的人体临床研究支持耐受性，包括在高于成人叶酸（folic acid）可耐受最高摄入量（UL）的摄入量下。总体而言，这些数据支持二胆碱L-5-MTHF在拟用水平下的安全性。
研究背景方面，目前(6S)?5-甲基四氢叶酸（L-5-MTHF）作为食物中天然存在的主要叶酸形式，其钙盐、钠盐、葡萄糖胺盐等已在多国获批用作食品与膳食补充剂的叶酸来源，但现有还原型叶酸盐在水溶性与稳定性方面存在局限，可能影响部分剂型（如舌下制剂）的开发。合成叶酸（folic acid）为完全氧化稳定的合成前维生素，需经二氢叶酸还原酶（DHFR）限速还原方进入活性叶酸池，高摄入可能产生未代谢叶酸（UMFA）并带来潜在健康风险。二胆碱L-5-MTHF作为一种新型盐形式，旨在在保留L-5-MTHF生物活性的同时提高水溶性与稳定性，因此其安全性需在已有还原型叶酸盐与胆碱安全性数据基础上，通过针对性毒理学研究予以确认。研究人员开展本研究，是基于还原型叶酸盐在体内解离为L-5-MTHF阴离子与相应阳离子的特性，采用权重证据法整合已有L-5-MTHF盐毒理学与临床数据，并对二胆碱L-5-MTHF本身开展标准体外致突变性组合试验，以确认其是否引入新的遗传毒性危害，从而在拟用水平下支持其作为膳食叶酸来源的安全性。研究结论显示，二胆碱L-5-MTHF在体外致突变性试验中均为阴性，结合已有钙、钠、葡萄糖胺L-5-MTHF盐的亚慢性毒性、发育毒性及多项人体临床耐受性数据，以及胆碱的充足摄入量（AI）与可耐受最高摄入量（UL）评估，在拟用条件下不会造成安全性担忧，可用于部分或完全替代叶酸及其他叶酸盐以满足推荐膳食摄入量（RDA）。该论文发表于《Toxicology Reports》。
为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：首先通过GLP合规的体外遗传毒性标准组合试验直接评价二胆碱L-5-MTHF，包括细菌回复突变试验（OECD TG 471）使用鼠伤寒沙门氏菌TA1537、TA1535、TA98、TA100及大肠杆菌WP2 uvrA(pKM101)菌株，在±S9代谢活化条件下至5000 μg/皿；体外染色体畸变试验（OECD TG 473）使用健康非吸烟成人供者外周血淋巴细胞，在±S9及连续暴露条件下至2000 μg/mL；体外哺乳动物微核试验（OECD TG 487）使用另一成人供者外周血淋巴细胞，在±S9及4小时与44小时暴露条件下至2000 μg/mL评价微核频率。同时研究人员通过靶向文献综述整合已发表的钙L-5-MTHF、钠L-5-MTHF等的重复给药毒性、发育毒性及人体临床试验数据，并结合胆碱安全性（AI与UL）进行权重证据整合，未专门开展二胆碱L-5-MTHF的重复给药动物研究。
研究结果部分保留原文小标题并依内容说明如下：
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Study results
研究人员汇总致突变性结果并显示，二胆碱L-5-MTHF在三项体外试验中均为阴性。
3.1. Bacterial reverse mutation assay
研究人员通过平板掺入法与预培养法在±S9条件下测试至5000 μg/皿，发现二胆碱L-5-MTHF在任何浓度均未增加任一测试菌株的回复突变菌落数，无细胞毒性与沉淀，阳性对照有效，因此结论为该受试物在此试验中无诱变性。
3.2. In vitro chromosome aberration assay
研究人员在±S9及4小时与24小时暴露条件下测试至2000 μg/mL，以相对有丝分裂指数评价毒性，在各浓度下异常细胞率均在实验室历史对照范围内，无生物学相关或剂量反应性增加，Fisher精确检验与趋势X2检验均无统计学显著升高，阳性对照诱导明确增高，因此结论为该受试物不诱导人淋巴细胞结构染色体畸变，无裂裂源性。
3.3. In vitro mammalian micronucleus assay
研究人员在±S9及4小时与44小时暴露条件下测试至2000 μg/mL，细胞抑制率除44小时最高浓度达32%外均低于30%，微核化细胞频率在各浓度下均在历史对照范围（0.11%–1.11%）内且无显著升高，阳性对照诱导显著增加，因此结论为该受试物不诱导培养人淋巴细胞微核增加，无裂裂源性与非整倍体源性活性。
讨论部分总结：研究人员指出二胆碱L-5-MTHF在水溶液中自由解离为L-5-MTHF与胆碱，电导率与钙盐相当，生物利用度等价，因此其安全性可基于L-5-MTHF与胆碱分别评估。体外三项致突变试验阴性排除了新型盐形式引入DNA反应性的可能，与已有其他L-5-MTHF盐致突变性特征一致。虽未专门开展重复给药研究，但已有钙L-5-MTHF（90天至400 mg/kg bw/日，NOAEL为最高剂量）与钠L-5-MTHF（90天至1000 mg/kg bw/日，NOAEL为最高剂量）的大鼠亚慢性研究及发育毒性研究均未发现不良影响，其中肌酸激酶变化被判定为单碳循环适应性非不良反应，并被EFSA与美国FDA接受；多项人体临床研究在高达15 mg/日剂量下支持L-5-MTHF盐耐受性，高于叶酸UL（1 mg/日）仍无明显不良模式。胆碱方面，拟用水平下额外摄入约187 μg/日远低于成人AI（425–550 mg/日）与UL（3.5 g/日），无实质影响。相比合成叶酸可能产生UMFA，还原型叶酸如二胆碱L-5-MTHF不需DHFR还原，不贡献UMFA，可能在高叶酸摄入关切中具有优势。综合权重证据表明二胆碱L-5-MTHF在拟用条件下无安全担忧。
研究结论部分翻译：这些数据支持二胆碱L-5-MTHF作为膳食叶酸来源在其预期用途中的安全性。研究人员通过对二胆碱L-5-MTHF开展的标准体外组合试验（包括细菌回复突变、染色体畸变和哺乳动物微核试验）确认了其无致突变潜力。此外，一项针对二胆碱L-5-MTHF的临床研究证实其可提供与其他还原型叶酸盐一致的生物可利用L-5-MTHF。由于还原型叶酸盐在生理条件下发生生理性解离，二胆碱L-5-MTHF的安全性基于其各自离子胆碱和L-5-MTHF确立。因此，现有关于其他叶酸盐（包括临床前与临床研究）的研究为预期使用条件下二胆碱L-5-MTHF的安全性提供了充分数据。临床前研究提供了很高的安全边际，而临床研究长期支持多种还原型叶酸盐在甚至高于1 mg/日UL剂量下的安全摄入。总体而言，现有证据支持二胆碱L-5-MTHF在拟用条件下不存在安全性担忧的结论。
