靶向可溶性PD-1通过调节PD-L1再循环和间皮-间充质转化减轻腹膜纤维化

《Translational Research》：Targeting Soluble PD-1 Alleviates Peritoneal Fibrosis by Modulating PD-L1 Recycling and Mesothelial-Mesenchymal Transition

　　

背景：腹膜纤维化（PF）是长期腹膜透析（PD）患者技术失败的主要原因，由慢性微炎症状态驱动。虽然T细胞活化与之相关，但主要来源于活化T细胞的可溶性程序性死亡受体-1（sPD-1）在PF发病机制中的作用仍不清楚。方法：研究人员首先分析了PD患者血清sPD-1水平，并采用高糖透析液和脂多糖（LPS）诱导的小鼠PF模型。通过给予PD-L1融合蛋白或设计用于吸附sPD-1的工程化外泌体，评估了sPD-1对PF进展的功能影响。结果：长期PD患者血清sPD-1水平显著升高，且与透析时间和纤维化标志物呈正相关，与腹膜功能呈负相关。在小鼠中，外源性sPD-1加重了PF，而使用PD-L1融合蛋白或吸附sPD-1的工程化外泌体进行阻断则显著减轻了纤维化，减少了T细胞浸润，并保护了腹膜功能。机制上，sPD-1与间皮细胞（PMCs）上的PD-L1结合，触发了网格蛋白介导的内吞作用。这种相互作用将PD-L1从溶酶体降解途径转向Rab11阳性再循环内体途径，导致表面PD-L1表达持续上调。这种异常的PD-L1再循环激活了促纤维化信号，最终导致间皮-间充质转化（MMT）。结论：PD-1通过调节间皮细胞中PD-L1的内吞命运，成为连接腹膜微炎症与纤维化的关键介质。靶向sPD-1，特别是使用工程化外泌体或PD-L1融合蛋白，代表了预防和治疗腹膜纤维化的一种有前景的治疗策略。

**论文解读文章**

**研究背景与目的**
腹膜透析（PD）是终末期肾病患者的重要替代治疗手段，但长期暴露于非生理性高糖透析液可导致腹膜纤维化（PF），这是PD技术失败的主要病理基础。PF以间皮下增厚、新生血管形成和超滤功能丧失为特征，其核心启动事件是腹膜间皮细胞（PMCs）的间皮-间充质转化（MMT）。目前认为，慢性微炎症状态是驱动MMT和纤维化的关键因素，而T细胞活化在其中发挥重要作用。然而，连接免疫活化与纤维化转化的直接分子效应器仍未明确。可溶性程序性死亡受体-1（sPD-1）是免疫检查点受体PD-1的循环亚型，主要来源于活化T细胞的脱落，在多种慢性炎症和自身免疫疾病中升高。本研究旨在阐明sPD-1在PF中的致病作用及其机制，并探索靶向sPD-1的治疗潜力。论文发表在《Translational Research》。

**主要技术方法**
研究团队从西京医院（西安）纳入64例PD患者，分为新置管对照组、短期PD组（<24个月）和长期PD组（>24个月），分析血清sPD-1水平。采用C57BL/6小鼠腹腔注射4.25%高糖透析液联合脂多糖（LPS）建立PF模型，通过给予重组sPD-1融合蛋白、PD-L1融合蛋白或工程化外泌体进行干预。工程化外泌体由转染了pcDNA3.1(-)-TRaptavidin-His-PTGFRN质粒的HEK-293T细胞制备，装载生物素化抗PD-1抗体。利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析sPD-1刺激的PMCs转录组，并通过免疫荧光、流式细胞术、Western blotting等检测内吞途径和MMT标志物。

**研究结果**
1. **Elevated Serum sPD-1 Correlates with Peritoneal Dysfunction in PD Patients**：通过ELISA检测发现，长期PD患者血清sPD-1水平显著高于短期患者和对照组，且与透析时间、MMP-2（基质金属蛋白酶-2）及IL-6（白细胞介素-6）水平呈正相关，与超滤失败风险增加及腹膜功能下降（D/P肌酐升高、D/D₀葡萄糖降低）显著相关，表明sPD-1可作为腹膜功能障碍的临床标志物。
2. **Exogenous sPD-1 Exacerbates Peritoneal Fibrosis and Immune Activation in Mice**：在小鼠PF模型中，给予重组sPD-1融合蛋白显著加重了腹膜增厚、胶原沉积（α-SMA、纤连蛋白上调，E-钙黏蛋白下调），并增强了腹膜CD3⁺和CD8⁺T细胞浸润，同时导致腹膜转运功能严重受损，表明sPD-1直接促进纤维化和免疫活化。
3. **Blockade of sPD-1 by PD-L1 fusion protein Ameliorates Peritoneal Fibrosis**：给予PD-L1融合蛋白（中和循环sPD-1）后，小鼠血清sPD-1水平降低，腹膜厚度和纤维化评分显著减轻，α-SMA、纤连蛋白和胶原I表达下调，E-钙黏蛋白恢复，腹膜超滤功能改善，T细胞浸润减少，且无肝肾毒性，证明阻断sPD-1可有效缓解纤维化。
4. **Engineered Exosomes Capturing sPD-1 Alleviate Peritoneal Fibrosis in PD Mice**：构建的工程化外泌体（携带抗PD-1抗体）经腹腔给药后，显著降低血清sPD-1水平，减少腹膜厚度，下调纤维化标志物，恢复E-钙黏蛋白表达，改善腹膜功能（D/D₀升高、D/P降低），并减少CD3⁺和CD8⁺T细胞，无肝肾毒性，表明外泌体是一种高效、安全的sPD-1捕获工具。
5. **scRNA-seq identifies MMT and the pathway in mesothelial cells stimulated by sPD-1**：对sPD-1刺激的PMCs进行单细胞转录组分析，主成分分析显示两组显著分离，鉴定出702个差异表达基因，其中纤维化相关基因（Mmp9、胶原I、纤连蛋白）上调。GO富集显示“细胞外基质”和“细胞外空间”显著富集；KEGG分析强调“ECM-受体相互作用”、“TNF信号通路”、“IL-17信号通路”和“PI3K-Akt信号通路”被激活。GSEA进一步证实“ECM-受体相互作用”和“突触囊泡循环”通路上调，提示内吞囊泡运输在sPD-1信号中发挥作用。
6. **sPD-1 Promotes Fibrosis by aberrant PD-L1 recycling**：机制研究表明，sPD-1与PMCs表面PD-L1结合，触发网格蛋白介导的内吞作用（被Pitstop2抑制，而非Filipin III）。内吞的sPD-1/PD-L1复合物主要与再循环内体标记物Rab11共定位，而非溶酶体标记物Lamp1，导致PD-L1从降解途径转向再循环途径，从而剂量依赖性地增加总PD-L1和表面PD-L1表达。这种异常再循环进而促进MMT（α-SMA上调、E-钙黏蛋白下调），而内吞抑制剂Pitstop2可阻断该效应。

**讨论与结论**
讨论部分指出，sPD-1不仅是炎症的旁观者，而是通过MMP-2脱落并直接破坏间皮细胞稳态的促纤维化因子。临床数据支持其作为动态预后标志物的价值，但单中心样本量有限，需多中心验证。机制上，sPD-1劫持PD-L1的内吞再循环途径，导致PD-L1异常积累并激活IL-17等促炎信号，进而驱动MMT。PD-L1融合蛋白虽有效但存在药代动力学挑战和免疫原性风险；工程化外泌体因靶向炎症组织、保护抗体免受降解而显示更优疗效，但制造成本和免疫原性（如MHC分子、TLR激活）仍需解决。未来应开发小分子抑制剂干扰sPD-1/PD-L1相互作用或阻断再循环机器，并联合代谢调节剂实现协同治疗。研究结论：本研究将sPD-1定义为整合多种炎症和代谢信号的关键临床相关PF驱动因子。PD-L1融合蛋白提供了sPD-1中和的概念验证，而工程化外泌体虽成本高，但克服了大分子和游离抗体的局限性，代表了一种更精细的治疗方式。这些发现为通过精准医学策略保护PD患者腹膜功能、改善长期预后铺平了道路。