SMARCA4、STK11与KEAP1共失活与肺腺癌预后不良及转化生长因子-β（TGF-β）通路上调相关

《Translational Oncology》：SMARCA4, STK11, and KEAP1 co-inactivation associates with poor prognosis and upregulation of the TGF-β pathway in lung adenocarcinoma

　　

背景：肺腺癌（LUAD）在临床与分子水平上由致癌驱动突变定义，此类突变的识别推动了驱动基因靶向疗法的开发，并显著改善了部分LUAD患者的预后。近期在多位点基因改变背景下评估临床结局的研究，识别出可能解释靶向疗法、化疗及免疫治疗差异反应的继发性突变。SMARCA4的基因失活或缺失常与STK11及KEAP1的功能丧失突变共发生，尤其能预测LUAD患者不论驱动状态如何均会出现预后不良及总生存期缩短。研究人员试图考察LUAD中SMARCA4缺陷伴随或不伴随STK11/KEAP1功能缺失的临床与功能关联。方法：研究人员通过对具有临床注释的LUAD样本进行基因组与转录组测序分析，考察了SMARCA4缺失、基因表达与预后之间的相关性。研究人员构建了伴有或不伴有STK11与KEAP1 concomitant敲除的SMARCA4基因敲除同源细胞系模型，以在体外与体内表征感兴趣的突变定义基因型。最后，研究人员探究了SMARCA4/STK11/KEAP1三重突变模型对转化生长因子-β（TGF-β）信号传导的功能依赖性，以评估其作为治疗靶点的潜力。结果：SMARCA4/STK11/KEAP1三重突变LUAD与生存不良及高频多发位点转移相关。SMARCA4/STK11/KEAP1三重敲除模型在体外显示出增强的迁移与侵袭能力，并在体内心内异种移植转移实验中表现出多样化的器官趋向性。对这些体外模型与临床样本的RNA测序（RNA-Seq）及DNaseI测序（DNaseI-Seq）分析，识别出在SMARCA4/STK11/KEAP1三重突变LUAD中存在TGF-β信号传导与上皮间质转化（EMT）基因表达特征的上调，以及相应的染色质可及性变化。结论：研究人员将SMARCA4/STK11/KEAP1三重突变LUAD识别为一个具有显著预后意义的疾病亚群，并提出TGF-β信号传导作为潜在的治疗靶点。

研究背景方面，肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌（NSCLC）的最主要亚型，尽管针对致癌驱动突变的靶向疗法与免疫疗法改善了部分患者结局，但许多LUAD患者缺乏可靶向突变而未获益，且获得性耐药普遍。LUAD具有高度异质性，除经典驱动突变外，STK11、KEAP1与SMARCA4的反复失活在KRAS突变及无驱动基因突变的LUAD中均被报道，且与生存缩短、化疗、免疫治疗及KRAS^G12C共价抑制剂疗效降低相关。这三个基因位于染色体19p，常因杂合性缺失（LOH）而共受影响，但SMARCA4/STK11/KEAP1三重突变LUAD的生物学特征此前鲜有表征，临床测序研究因三重突变样本量限制难以厘清其独立影响，且既往关于SMARCA4缺失与疗法反应关联的结论存在冲突，很可能受共突变干扰。为此，研究人员旨在解析伴或不伴STK11与KEAP1共失活的SMARCA4缺失在LUAD中的临床与功能关联，明确三重突变亚群的预后意义与潜在机制，为精准治疗提供依据。该研究论文发表在《Translational Oncology》。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：基于纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）接受MSK-IMPACT检测的LUAD临床队列，筛选SMARCA4、STK11、KEAP1功能丧失突变样本并分组；利用FACETS算法进行DNA拷贝数与癌细细胞分数（CCF）分析以界定双等位基因失活；通过Kaplan–Meier法与Cox比例风险模型评估总生存（OS）与风险比（HR），结合自然语言处理的ClinicalBERT提取影像报告转移位点数据；采用CRISPR/Cas9技术构建SMARCA4单敲除、STK11/KEAP1双敲除（DKO）及三重敲除（TKO）的NCI-H358等LUAD同源细胞系模型；对临床原发肿瘤样本与细胞系进行RNA测序（RNA-Seq）差异表达与基因集富集分析（GSEA），辅以DNaseI测序（DNaseI-Seq）分析染色质可及性；通过Transwell迁移与Matrigel侵袭实验、NSG小鼠心内异种移植转移模型与生物发光成像（BLI）评估体外体内转移表型；采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测TGF-β1分泌，Western blot检测BRG1、SMAD磷酸化及EMT标志物蛋白表达，并使用TGF-βⅠ型受体激酶抑制剂SB-431542进行功能验证。

研究结果部分保留原文小标题并依内容总结如下：

SMARCA4 only mutant与SMARCA4/STK11/KEAP1 triple mutant肿瘤具有独特的共突变模式。研究人员通过对MSK-IMPACT测序的5048例LUAD队列分组（SMARCA4 Only组129例、Double Mutant组180例、Triple Mutant组47例、Unaltered组4692例）分析发现，三重突变组吸烟史与肿瘤突变负荷（TMB）更高；SMARCA4 Only组显著富集TP53突变，Double与Triple Mutant组更富集KRAS突变且均与EGFR突变互斥，Triple Mutant组还富集ATM突变。FACETS分析显示三重突变组所有样本均存在SMARCA4与KEAP1基因丢失，STK11更易局灶缺失，SMARCA4与KEAP1缺失模式几乎一致，源于二者在19p上相距仅约0.5 Mb；Triple Mutant组SMARCA4双等位缺失率（74%）高于SMARCA4 Only组（56%），但未达统计学显著，证实19p臂水平缺失驱动三基因共LOH。

SMARCA4/STK11/KEAP1 triple mutant患者生存最低且多部位转移发生率最高。生存分析显示Triple Mutant组总生存最短（中位8.4个月，HR=4.54对比Unaltered组），风险高于SMARCA4 Only组（中位28.3个月，HR=1.50）与Double Mutant组（中位23.6个月，HR=1.70），且在仅晚期（IV期）患者中仍成立；其转移部位数量显著多于Double Mutant组，多部位及非常规部位转移频率最高。治疗亚组分析显示Triple Mutant组在化疗与免疫治疗下生存均最差，而SMARCA4 Only组免疫治疗生存略优于Unaltered组，表明STK11/KEAP1共失活在SMARCA4突变LUAD中对预后与治疗反应有关键影响。

SMARCA4缺失基因特征随STK11/KEAP1共突变状态而异。对11例SMARCA4 Only、11例Double Mutant、9例Triple Mutant与18例Unaltered原发肿瘤RNA-Seq分析显示，SMARCA4 Only对比Unaltered上调线粒体生理与氧化磷酸化（OXPHOS）、细胞周期、干扰素（IFN）-α/γ通路，下调肺泡Ⅱ型（AT2）细胞标志物并上调黏液细胞相关通路；Triple Mutant对比Double Mutant则特异性上调TGF-β信号传导与上皮间质转化（EMT）相关基因集，且Triple Mutant组AT2标志物丢失最显著，提示三重突变LUAD分化更低，TGF-β-EMT上调可能是其高转移与不良预后的分子关联。

SMARCA4/STK11/KEAP1共失活促进TGF-β信号传导与EMT表型。研究人员在KRAS^G12D突变NCI-H358细胞中构建SAFE、SMARCA4^KO、DKO、TKO同源模型，Western blot确认敲除后RNA-Seq显示TKO对比DKO显著富集TGF-β与EMT基因集，DNaseI-Seq显示TGF-β通路基因染色质可及性增加；TKO克隆磷酸化SMAD2（p-SMAD2）升高，EMT转录因子SNAI1、ZEB1及间质标志物N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）上调，上皮标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）降低，ELISA与转录本均显示TKO分泌TGF-β1与TGF-β2最高，在KRAS^G13C突变H1355细胞中也复现此现象而KRAS野生型H292未见，表明TGF-β上调具STK11/KEAP1共缺失背景特异性且与KRAS突变背景相关。

H358 TKO模型呈现EMT相关特征与增强的转移能力。体外观察TKO克隆呈细长扁平形态，虽倍增率无差异但Transwell迁移与Matrigel侵袭能力显著高于DKO（迁移p<0.0002，侵袭p<0.02），DKO又显著高于SAFE。NSG小鼠心内异种移植中，TKO、DKO、SMARCA4^KO肿瘤生长速度快于SAFE，TKO小鼠转移部位最广（脑、肾上腺、骨、腹内等多器官），DKO次之，SAFE与SMARCA4^KO仅单部位转移；TGF-βⅠ型受体抑制剂SB-431542处理可部分降低TKO与DKO迁移能力（TKO减少约25–40%），提示TGF-β活性参与其转移表型。

讨论部分总结：研究人员指出临床基因组分析捕获了三重突变与经典LUAD驱动基因的共现及三重突变与不良预后、高转移负荷的关联，确认19p共LOH频发与Triple Mutant组SMARCA4双等位缺失富集，推测更具破坏性的SMARCA4突变可能促成极差预后；强调既往SMARCA4缺失与疗法反应矛盾结论源于未分层STK11/KEAP1状态，本研究显示SMARCA4 Only免疫治疗生存不劣于野生型，而三重突变均差，未来需在大队列中细分三重突变以推进精准医学。转录组分析显示无论STK11/KEAP1背景，SMARCA4突变均上调IFN-α/γ与下调AT2标志物，Triple Mutant特异性上调TGF-β可能与去分化及癌干细胞样特征相关。同源模型验证TGF-β-EMT上调为三重突变共有特征，KRAS突变背景可能协同TGF-β诱导EMT但临床数据提示或非完全依赖KRAS；SMARCA4缺失解除肺谱系表观约束增强转录可塑性，STK11/KEAP1共失活可能将此可塑性导向TGF-β驱动的EMT。TGF-β还可能通过免疫逃逸加剧不良结局，未来需在免疫健全模型中探索TGF-β抑制联合疗法。

结论部分原文翻译：在本研究中，研究人员综合临床基因组数据、转录组分析以及体外与体内表型实验，表征了LUAD中SMARCA4缺失单独发生及伴随STK11与KEAP1失活的临床背景下的特征。研究人员确定总生存缩短、转移负荷与播散增加、转移相关表型增强，以及TGF-β与EMT转录特征上调是LUAD中SMARCA4/STK11/KEAP1共缺失的区分性特征。鉴于目前缺乏靶向治疗且SMARCA4/STK11/KEAP1三重突变LUAD患者预后不良，这些发现确立了探究该背景下TGF-β上调与依赖的机制起源、阐明TGF-β活性与转移相关表型联系的合理性，并在未来临床基因组研究中将三重突变患者视为LUAD中具有临床独特性与预后意义的亚群加以考量。