KLF16通过PRKDC上调PD-L11表达促进肝细胞癌细胞免疫逃逸

《Translational Oncology》：KLF16 promotes immune escape in hepatocellular carcinoma cells by upregulating PD-L1 expression via PRKDC

　　

程序性死亡配体1（PD-L1）驱动的免疫逃逸是肝细胞癌（HCC）进展的关键机制。此外，Krüppel样因子16（KLF16）可能是调控该过程的关键分子。因此，研究人员研究了KLF16在HCC中PD-L1驱动免疫逃逸中的作用。方法：将Hepa1–6细胞皮下注射到BALB/c小鼠和裸鼠的右背部，建立荷瘤模型。通过流式细胞术检测肿瘤组织中CD8⁺ T细胞的丰度。采用RT?qPCR、Western blotting、免疫荧光和免疫组织化学分析关键基因和蛋白的表达。结果：KLF16在HCC组织中显著高表达，并与T细胞受体信号通路的富集相关。敲低KLF16抑制Hepa1–6细胞中PD-L1表达，而过表达KLF16则促进PD-L1表达。KLF16敲低显著抑制肿瘤生长，且在免疫健全小鼠中的抑制效果明显强于裸鼠。此外，KLF16敲低增加了荷瘤组织中CD8⁺ T细胞浸润，以及颗粒酶B（GzmB）和干扰素-γ（IFN-γ）阳性CD8⁺ T细胞的数量，并增强了抗PD-1和抗CTLA-4联合疗法的抗肿瘤效果。机制上，KLF16不直接调控PD-L1转录，而是结合PRKDC（编码DNA依赖性蛋白激酶催化亚基DNA-PK的基因）的启动子，激活PRKDC转录。随后DNA-PK的升高可能磷酸化PD-L1，从而增强PD-L1蛋白稳定性。结论：KLF16通过转录激活PRKDC促进PD-L1表达，从而促进HCC免疫逃逸。KLF16敲低增强免疫检查点抑制剂的疗效，提示KLF16是HCC免疫治疗的潜在靶点。

**论文解读：KLF16通过转录激活PRKDC上调PD-L1表达促进肝细胞癌免疫逃逸的机制研究**

**研究背景与问题**

肝细胞癌（HCC）是全球第三大癌症相关死亡原因，早期患者可通过手术、肝移植或局部介入治疗治愈，但晚期主要依赖全身治疗，预后较差。近年来，免疫治疗成为手术、放疗和化疗后的重要策略，其中程序性死亡受体1（PD-1）与程序性死亡配体1（PD-L1）的相互作用是HCC免疫逃逸的关键机制：PD-L1在HCC细胞表面过表达，与T细胞表面PD-1结合后抑制T细胞增殖和活化，导致T细胞失活，最终引发免疫逃逸和治疗失败。尽管PD-L1/PD-1靶向药物等免疫检查点抑制剂（ICIs）已用于临床治疗，但仅少数患者获益，且耐药问题严重限制了其应用，因此亟需开发ICIs增敏疗法。Krüppel样因子16（KLF16）属于锌指转录因子家族，可结合靶基因的GT或GC富集区调控转录，在胚胎发生、发育和癌症进展中发挥重要作用。KLF16在多种癌症中呈现异质性，如在胰腺癌中促进增殖和迁移，在乳腺癌中高表达与不良预后相关，在胃腺癌中可能参与免疫逃逸过程。近期研究提示KLF16可增加PD-L1表达，促进HCC进展和免疫逃逸，但其具体机制尚不完全清楚。蛋白激酶DNA激活催化多肽基因（PRKDC）编码DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）催化亚基，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在DNA双链断裂修复中起关键作用，同时在其他癌症中也被认为具有促肿瘤作用，如抑制PRKDC可增强M1巨噬细胞浸润，在骨肉瘤中过表达导致多西他赛耐药。此外，DNA-PK已被发现可直接磷酸化PD-L1的苏氨酸-20和苏氨酸-22位点，稳定PD-L1蛋白，从而驱动胃癌细胞免疫逃逸，但在HCC中是否通过该机制发挥作用尚需验证。因此，本研究旨在探究KLF16在HCC免疫逃逸中的角色，并阐明其通过PRKDC调控PD-L1稳定性的潜在机制，为HCC免疫治疗提供新靶点。

**主要技术方法**

研究人员从Yunnan Cancer Hospital收集了16对HCC及配对癌旁组织标本（所有患者术前未接受放化疗）。采用小鼠HCC细胞系Hepa1–6，通过慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）进行KLF16敲低或过表达，并构建PRKDC过表达细胞株。体内实验使用BALB/c裸鼠和BALB/c免疫健全小鼠，皮下注射Hepa1–6细胞建立荷瘤模型，并联合抗PD-1和抗CTLA-4单克隆抗体治疗。基因表达分析采用RT?qPCR和Western blot；蛋白定位和表达采用免疫荧光和免疫组化；免疫细胞浸润通过流式细胞术检测CD8⁺ T细胞及其功能标志物（GzmB和IFN-γ）；转录调控机制通过荧光素酶报告基因实验和生物信息学分析（TCGA、UniProt、Cistrome数据库的Venn分析及UCSC数据库结合位点预测）验证。

**研究结果**

**1. KLF16在肝癌样本中高表达并与免疫相关**
研究人员通过RT?qPCR和Western blot检测临床HCC组织，发现KLF16的mRNA和蛋白水平均显著高于癌旁组织。单基因通路富集分析显示KLF16与T细胞受体信号通路显著富集，提示其可能参与HCC免疫过程。在Hepa1–6细胞中敲低KLF16后，RT?qPCR检测发现TNFSF9、IL7R、ZP3、LCK和NR4A3的mRNA表达下降，而IL6R水平升高。用IFN-γ处理模拟体内免疫微环境后，KLF16和PD-L1表达均显著上调，表明KLF16在HCC中上调并与免疫相关。

**2. KLF16增强肝癌细胞中PD-L1表达**
成功构建KLF16过表达（OE-KLF16）和敲低（sh-KLF16）的Hepa1–6细胞后，Western blot和免疫荧光显示KLF16过表达促进PD-L1蛋白水平升高，而敲低KLF16（无论是否经IFN-γ处理）均显著降低PD-L1表达，证实KLF16正向调控PD-L1。

**3. KLF16通过促进PRKDC转录上调PD-L1表达**
荧光素酶报告基因实验显示，KLF16干扰质粒不影响PD-L1启动子活性，表明KLF16不直接结合PD-L1启动子。通过TCGA、UniProt和Cistrome数据库的Venn分析，筛选出64个重叠基因，其中PRKDC结合评分最高，且在HCC中表达上调。UCSC数据库预测KLF16结合PRKDC启动子区域。在Hepa1–6细胞中，KLF16敲低抑制PRKDC mRNA和DNA-PK蛋白表达，而KLF16过表达则促进其表达。在KLF16敲低细胞中过表达PRKDC可部分恢复PD-L1水平，证实KLF16通过转录激活PRKDC上调PD-L1。

**4. KLF16敲低增强T细胞抗肿瘤免疫**
在BALB/c裸鼠和免疫健全小鼠中，KLF16敲低均显著抑制肿瘤生长，降低Ki67表达，且免疫健全小鼠中的抑制效果更明显。流式细胞术显示，KLF16敲低增加肿瘤组织中CD8⁺ T细胞比例，以及GzmB⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞比例，同时降低肿瘤组织中KLF16和PD-L1蛋白表达，表明KLF16敲低促进T细胞驱动的抗肿瘤免疫。

**5. KLF16敲低增强联合免疫检查点阻断疗法的疗效**
在BALB/c小鼠中，KLF16敲低联合抗PD-1和抗CTLA-4单抗治疗进一步抑制肿瘤生长，降低Ki67表达，并显著增加CD8⁺ T细胞浸润及GzmB⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞比例，提示KLF16敲低可增强免疫检查点抑制剂的疗效。

**讨论与结论**

本研究表明，KLF16在HCC中高表达，通过转录激活PRKDC上调DNA-PK，进而促进PD-L1表达，驱动免疫逃逸。KLF16不直接结合PD-L1启动子，而是通过调控PRKDC转录来实现。体内实验证实KLF16敲低可抑制肿瘤生长、增强T细胞免疫，并增敏抗PD-1和抗CTLA-4联合治疗。因此，KLF16是HCC免疫治疗的潜在靶点，但该研究未评估KLF16敲低联合ICIs的安全性和有效性，也缺乏靶向KLF16的药物，这些将是后续研究的关键问题。研究结论：KLF16通过转录激活PRKDC促进PD-L1表达，从而促进HCC免疫逃逸；KLF16敲低增强免疫检查点抑制剂的疗效，提示KLF16是HCC免疫治疗的潜在靶点。