TMC7通过抑制蛋白激酶N2（PKN2）并调控缺氧适应性反应促进结直肠癌转移

《Translational Oncology》：TMC7 promotes colorectal cancer metastasis via inhibition of PKN2 and regulation of hypoxia-adaptive responses

　　

转移是结直肠癌（CRC）患者死亡的首要原因。缺氧性肿瘤微环境通过激活缺氧适应性反应以及Warburg效应促进CRC进展。本研究考察跨膜通道样蛋白7（TMC7）在CRC转移中的作用。TMC7在患者CRC组织中显著上调，尤其在转移灶中表达更高。TMC7高表达与生存率降低及异时性肝转移发生率升高相关。此外，TMC7高表达肿瘤表现出增强的葡萄糖摄取能力。体外实验表明，在缺氧条件下，TMC7促进CRC细胞增殖和侵袭，并伴随缺氧诱导因子1α（HIF1α）核转位及缺氧适应性反应激活。体内实验显示，在裸鼠异种移植模型中，TMC7显著加速肺转移并缩短总生存期。机制研究表明，蛋白激酶N2（PKN2）作为HIF1α活性的负性调控因子，可抑制缺氧适应和糖酵解。TMC7通过抑制PKN2活性，解除其对HIF1α的抑制作用，并促进HIF1α在细胞核内积累。该级联过程最终增强糖酵解通量并支持转移进展。重要的是，PKN2异位表达可逆转TMC7诱导的促转移及代谢重编程表型。此外，TMC7升高还可预测化疗和免疫治疗后较差的临床结局。综上，这些发现揭示了一条新的TMC7–PKN2–HIF1α信号轴，该信号轴通过调控缺氧适应和Warburg效应驱动CRC转移。本研究为CRC转移提供了新的机制性认识，并提示TMC7可作为转移性疾病精准治疗的潜在靶点。

该研究发表于《Translational Oncology》，聚焦结直肠癌（CRC）转移的分子机制，尤其关注缺氧微环境驱动的代谢重编程在肿瘤进展中的作用。结直肠癌是全球常见恶性肿瘤之一，而转移，特别是肝转移，是造成患者死亡的主要原因。既往研究表明，转移灶较原发灶常具有更显著的缺氧状态，缺氧可通过稳定缺氧诱导因子1α（HIF1α，一类调控细胞低氧应答的关键转录因子）促进血管生成、糖酵解增强以及Warburg效应，从而帮助肿瘤细胞在不利环境中存活、侵袭并远处播散。然而，结直肠癌细胞如何获得缺氧适应能力、以及这一过程上游调控因子为何，仍缺乏充分阐明。

TMC7属于跨膜通道样蛋白家族，既往在肿瘤中的功能认识较少。研究人员此前已发现TMC7与胰腺癌不良预后相关，但其在结直肠癌中的表达特征、临床意义以及是否参与缺氧适应与转移尚不明确。与此同时，蛋白激酶N2（PKN2）已被报道可抑制HIF1α的核积累和转录活性，并在研究人员既往工作中显示出抑制结肠癌相关恶性生物学行为的作用。因此，本研究围绕TMC7、PKN2与HIF1α之间的调控关系展开，旨在揭示结直肠癌转移的新机制，并寻找潜在治疗靶点。

研究人员综合临床样本、TCGA-COAD与GTEx数据库、生物信息学分析、体外功能实验以及裸鼠转移模型，系统评估TMC7在CRC中的表达、与预后的关系及其功能。结果显示，TMC7在结直肠癌组织中显著高表达，在转移性肿瘤和肝转移灶中进一步升高；TMC7高表达与总生存期缩短、肝转移结节数增加、异时性肝转移发生率更高及肿瘤葡萄糖摄取增强相关。机制上，TMC7通过抑制PKN2激酶活性，解除PKN2对HIF1α的负调控，促进HIF1α核转位，进而增强缺氧适应性反应与Warburg效应，最终推动转移进展。研究还发现，PKN2过表达能够逆转TMC7诱导的增殖、侵袭、糖代谢增强及肺转移表型，支持二者间存在功能拮抗关系。该研究的重要意义在于首次系统提出TMC7–PKN2–HIF1α调控轴，将跨膜蛋白异常表达、缺氧应答与代谢重编程有机联系起来，为CRC转移的精准干预提供了新的理论依据和候选靶点。

在技术方法方面，研究主要采用以下策略：第一，纳入南方医院80例结直肠癌肝转移患者的原发灶、配对癌旁组织及肝转移灶样本，结合免疫组织化学（IHC）和部分病例PET-CT的标准摄取值（SUV）进行临床相关性分析；第二，利用TCGA-COAD、GTEx及泛癌数据库开展表达谱、差异基因、药物敏感性、肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）分析；第三，在HCT116、SW480、HT29及原代来源HU-CRC细胞中进行TMC7/PKN2过表达或敲低，结合CCK-8、Transwell、qPCR、免疫荧光、免疫沉淀及激酶活性检测；第四，采用Seahorse分析细胞外酸化率（ECAR）和氧耗率（OCR），并检测葡萄糖消耗与乳酸生成；第五，通过裸鼠尾静脉注射建立肺转移模型并进行生存分析。

在结果部分，论文首先通过“TMC7 is upregulated in CRC and correlates with tumor hypoxia”指出：基于TCGA COAD数据，TMC7在CRC组织中相较正常组织显著上调，并且在转移性肿瘤中高于非转移性肿瘤。突变分析显示TMC7在结肠癌中的突变频率较低，提示其异常主要体现为表达上调而非高频基因突变。差异基因与GO/KEGG分析提示TMC7相关分子网络与氧转运及缺氧相关功能密切联系。进一步药物反应预测显示，TMC7高表达组对多种化疗药及靶向药敏感性降低；同时其TMB更低，且在结肠癌中TMC7表达与MSI评分呈负相关，提示其可能与较差的免疫治疗获益有关。

在“TMC7 facilitates CRC metastasis via enhanced hypoxia adaptation”部分，研究人员对80例临床配对标本进行分析，发现正常结肠组织中TMC7表达较低，而肝转移灶中显著高于原发灶。TMC7高表达患者具有更多转移结节，且总生存时间明显缩短。肝转移模式分析显示，高TMC7表达队列异时性肝转移比例更高。体内实验进一步证实，TMC7过表达的HU-CRC细胞经尾静脉注射后可形成更多肺转移结节，并导致裸鼠生存缩短。体外实验则显示，在常氧下TMC7对增殖影响不明显，但在缺氧条件下明显促进CRC细胞增殖和侵袭，提示其促恶性作用具有明显缺氧依赖性。

在“TMC7 enhances the activity of HIF1α and inhibits the activity of PKN2”部分，研究将TMC7表达与¹⁸F-FDG PET-CT所示SUV值进行关联，发现TMC7高表达与更高平均SUV和最大SUV相关，说明其与增强葡萄糖摄取相联系。RNA测序显示TMC7过表达可引起大量差异表达基因变化，并富集于HIF-1信号通路、核质转运和泛素介导降解等关键通路。免疫荧光结果表明，在缺氧条件下，TMC7过表达促进HIF1α由胞质向细胞核积累。与此同时，葡萄糖消耗与乳酸生成显著增加；HIF1α抑制剂PX-478可逆转TMC7诱导的促增殖、促侵袭表型。机制实验进一步显示，PKN2并不显著调控TMC7表达，但TMC7可呈剂量依赖性抑制PKN2激酶活性，而敲低TMC7则增强PKN2活性，说明TMC7位于PKN2上游并对其具有抑制作用。

在“PKN2 suppresses the hypoxia-adaptive response in colon cancer cells”部分，研究发现PKN2在肝转移灶中的表达低于原发灶；高PKN2表达患者转移结节更少。进一步结合IHC与PET-CT分析可见，高PKN2病灶具有较低HIF1α表达和较低FDG摄取。统计上，PKN2与平均SUV呈负相关，与HIF1α亦呈显著负相关。功能实验表明，PKN2过表达可在缺氧条件下抑制CRC细胞增殖，证明PKN2具有抑制肿瘤细胞缺氧适应的作用。

在“PKN2 suppresses the Warburg effect in colon cancer cells”部分，研究通过代谢功能实验系统评价PKN2对Warburg效应的影响。PKN2敲低后，细胞外酸化率（ECAR）升高、氧耗率（OCR）降低，同时葡萄糖消耗与乳酸生成增加，提示糖酵解增强而氧化磷酸化受抑。相反，PKN2过表达下调糖酵解相关基因葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）mRNA水平，并减少葡萄糖消耗及乳酸生成。由此表明，PKN2可负向调控HIF1α驱动的糖酵解程序，从而抑制Warburg效应。

在“TMC7 suppresses PKN2 to inhibit HIF1α activation and the Warburg effect”部分，研究人员构建TMC7过表达、TMC7与PKN2共过表达及对照细胞，进一步验证二者因果联系。结果显示，TMC7过表达可增强裸鼠肺转移，而同时恢复PKN2表达后，肺转移结节减少且生存延长。体外方面，与TMC7单独过表达相比，TMC7与PKN2共过表达细胞的增殖和侵袭能力下降，葡萄糖消耗、乳酸生成及GLUT1、PDK1表达均降低，同时HIF1α核积累受损。该部分清晰证明：TMC7促进HIF1α激活和Warburg效应依赖于对PKN2的抑制，PKN2恢复表达能够逆转TMC7的促转移及代谢重编程作用。

讨论部分强调，转移灶定植需要肿瘤细胞适应与原发部位不同的微环境，而缺氧适应是其中关键环节。该研究将TMC7确定为结直肠癌中异常高表达并与转移负荷、代谢异常及不良预后相关的分子，同时提示其可能与较低化疗及免疫治疗反应性相关。研究还扩展了PKN2在结肠癌中的抑癌功能内涵，首次提出PKN2不仅抑制既往报道的血管生成和免疫调节过程，还可抑制缺氧耐受与Warburg效应。作者亦指出局限性，包括当前尾静脉肺转移模型不能完整模拟转移级联全过程，且体内缺少TMC7敲低模型验证；此外，TMC7/PKN2轴调控HIF1α的精确分子机制尚待进一步解析。

研究结论部分可译为：本研究首次系统阐明了TMC7通过抑制PKN2活性而促进CRC转移的分子机制，这一过程导致缺氧适应性反应增强并激活Warburg效应。新鉴定的TMC7-PKN2-HIF1α调控轴为开发针对CRC转移的靶向治疗提供了有前景的理论框架。该研究不仅推进了对CRC转移分子基础的理解，也为临床干预提供了重要理论支持和新的治疗靶点。