《Translational Oncology》：Identification and functional validation of a four-gene signature associated with radiotherapy resistance in oral squamous cell carcinoma
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放疗抵抗仍然是口腔鳞状细胞癌（OSCC）治疗的主要障碍。本研究旨在鉴定放疗相关的预后生物标志物，并探索其在OSCC中的功能相关性。通过整合单细胞RNA-seq（single-cell RNA sequencing）分析、基于TCGA（The Cancer Ge
放疗抵抗仍然是口腔鳞状细胞癌（OSCC）治疗的主要障碍。本研究旨在鉴定放疗相关的预后生物标志物，并探索其在OSCC中的功能相关性。通过整合单细胞RNA-seq（single-cell RNA sequencing）分析、基于TCGA（The Cancer Genome Atlas）的bulk转录组分析、Scissor分析、hdWGCNA（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis）和随机生存森林（random survival forest）建模，研究人员鉴定出一个由KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B组成的四基因风险标志物。该模型有效将患者分为高风险组和低风险组，并在TCGA-OSCC训练队列和GSE41613验证队列中显示出预后价值。免疫浸润、免疫检查点、恶性亚聚类、伪时间（pseudotime）、CellChat和虚拟敲除（virtual knockout）分析进一步表明，这些基因与肿瘤免疫重塑、恶性细胞异质性、氧化应激、铁死亡（ferroptosis）和细胞外基质相关通路有关。免疫组织化学验证显示，KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B在OSCC组织中上调，尤其是在放疗抵抗的OSCC组织中。在体外，HSC-3和SCC9细胞表现出相对较强的放疗抵抗性，而在SCC9细胞中通过siRNA介导的基因敲除增强了辐照诱导的代谢活性、集落形成和侵袭的抑制。总之，这些发现表明KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B可作为克服OSCC放疗抵抗的预后生物标志物和潜在治疗靶点。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，尽管治疗手段不断进步，但放疗抵抗仍然是导致局部复发、转移和预后不良的主要原因。传统临床病理参数（如肿瘤分期、淋巴结状态、组织学分级）主要反映解剖学肿瘤负荷，无法充分解释恶性细胞内在的放射敏感性差异，也难以早期识别放疗抵抗患者。放疗抵抗的生物学基础涉及DNA损伤修复增强、细胞周期检查点调控异常、凋亡抵抗、癌症干细胞特性、上皮-间充质转化、缺氧适应、代谢重编程、免疫逃逸以及肿瘤微环境重塑等多个复杂过程。目前，临床上缺乏能够有效预测OSCC放疗反应并指导放疗增敏策略的分子标志物。因此，有必要整合高通量测序数据，从单细胞和bulk转录组水平系统鉴定与放疗抵抗相关的恶性细胞程序和预后标志物。
**研究内容与结论**
研究人员通过整合OSCC单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集（GSE215403、GSE172577）与TCGA-OSCC及GEO（GSE41613）bulk转录组队列，采用Scissor分析、高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）、差异表达分析及随机生存森林（RSF）建模，构建了一个由KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B组成的四基因风险标志物。该模型能够有效将患者分为高风险组和低风险组，在TCGA-OSCC训练队列（1年、3年、5年受试者工作特征曲线下面积（AUC）分别为0.811、0.839、0.849）和GSE41613验证队列（AUC分别为0.617、0.636、0.621）中均显示出预后价值。进一步分析表明，该标志物与免疫细胞浸润、免疫检查点表达、恶性细胞异质性、分化轨迹、细胞间通讯以及氧化应激、铁死亡、细胞外基质（ECM）相关通路密切相关。免疫组织化学（IHC）验证显示，KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B在OSCC组织中表达上调，且在放疗抵抗组织中显著高于放射敏感组织。体外实验中，HSC-3和SCC9细胞表现出相对较强的放疗抵抗性；在SCC9细胞中分别敲低这四个基因，可增强辐照（6 Gy）诱导的代谢活性抑制、集落形成抑制和侵袭抑制。该研究发表在《Translational Oncology》，表明KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B可能作为OSCC放疗抵抗的预后生物标志物和潜在治疗靶点。
**主要关键技术方法**
研究人员采用的主要关键技术方法包括：整合单细胞RNA-seq（scRNA-seq）和bulk转录组分析，通过Seurat、Harmony进行数据预处理和批次校正，利用Scissor整合TCGA-OSCC放疗表型与单细胞矩阵鉴定放疗相关细胞群，通过hdWGCNA识别恶性细胞特异性共表达模块，结合DESeq2进行bulk差异表达分析，随机生存森林（RSF）建模构建预后风险模型。此外，还运用了单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估免疫浸润，CellChat分析细胞间通讯，scTenifoldKnk进行虚拟敲除，以及Monocle进行伪时间轨迹推断。样本队列来源包括TCGA-OSCC（训练队列）和GSE41613（验证队列），以及南方医科大学收集的OSCC组织样本（包括相邻正常组织、放射敏感和放疗抵抗组织，每组12例）。
**研究结果**
**1. OSCC单细胞转录组数据的质量控制、批次校正和初始聚类**
通过质量控制、Harmony批次校正和scDblFinder双细胞去除，从96,563个初始细胞中保留87,483个高质量单细胞，经主成分分析（PCA）和UMAP降维聚类，生成14个细胞簇。
**2. 整合OSCC单细胞图谱的细胞类型注释和功能特征**
基于经典标志物注释出8种主要细胞类型：T细胞、恶性细胞、髓系细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、B细胞和肥大细胞，其中恶性细胞占比最高（49.94%），且表现出较高的代谢活性。
**3. OSCC中放疗相关恶性细胞和差异表达基因的鉴定**
Scissor分析将细胞分为Scissor+、Scissor?和背景细胞，恶性细胞中Scissor+细胞数量最多（907个）。差异表达分析鉴定出4968个放疗相关差异表达基因（DEG），其中3160个在Scissor+细胞中上调。
**4. OSCC中恶性细胞相关基因模块和候选基因的鉴定**
hdWGCNA在恶性细胞中鉴定出7个共表达模块，M2、M4、M6模块与恶性细胞优先相关。DESeq2分析得到7191个OSCC相关DEG。三者交叉获得141个候选基因。
**5. OSCC中四基因预后风险模型的构建和验证**
单变量Cox回归筛选出KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B四个预后基因，风险比均大于1。RSF模型在TCGA-OSCC和GSE41613队列中均能有效区分高低风险组，且这四基因在OSCC组织中显著上调。
**6. OSCC中四基因风险模型相关的免疫浸润和免疫检查点特征**
ssGSEA分析显示高风险组有12种免疫细胞浸润显著改变，其中9种浸润评分降低。KPNA2、ARL6IP1、TUBA1B与活化CD4 T细胞正相关。BTN2A1和CD276等免疫检查点基因与风险模型基因正相关。
**7. OSCC中恶性细胞亚型的鉴定和特征**
恶性细胞重聚类为KRT1+、TGFBI+、RACK1+和CLU+四个亚型。CytoTRACE分析显示TGFBI+恶性细胞分化程度最低。伪时间分析表明P4HA1表达沿伪时间逐渐下降，而KPNA2、ARL6IP1和TUBA1B呈动态变化。
**8. CellChat和虚拟敲除分析揭示OSCC恶性细胞中的通讯网络和功能扰动**
CellChat分析显示TGFBI+和CLU+恶性细胞是活跃的通讯枢纽，涉及MIF、PPIA等配体-受体对。虚拟敲除四个基因后，显著扰动的基因富集于氧化应激、铁死亡、谷胱甘肽代谢、ECM重塑等通路。
**9. KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B在放疗抵抗OSCC组织中显著上调**
IHC染色显示，这四个蛋白在相邻正常组织中弱阳性，在OSCC组织中增强，且在放疗抵抗OSCC组织中阳性染色面积显著高于放射敏感组织。
**10. 辐射相关关键基因在OSCC细胞系中高表达并与放射敏感性差异相关**
qRT-PCR显示，与HOK细胞相比，四个基因在OSCC细胞系中显著上调，且在HSC-3和SCC9细胞中表达较高。辐照后CAL-27和SCC25细胞代谢活性下降更明显（放射敏感），而HSC-3和SCC9细胞保持较高代谢活性（放射抵抗）。
**11. 敲低KPNA2、P4HA1、ARL6IP1或TUBA1B增强放疗抵抗SCC9细胞的放射敏感性**
在SCC9细胞中，分别敲低四个基因后，联合6 Gy辐照可进一步降低代谢活性、集落形成和侵袭能力，表明这些基因参与维持放疗抵抗表型。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，放疗抵抗是OSCC治疗的主要挑战，而四基因标志物整合了单细胞和bulk数据，具有临床预后关联性和细胞特异性。该标志物与免疫重塑、恶性细胞异质性及应激相关通路密切相关，提示高风险患者可能具有放疗抵抗和免疫抑制的肿瘤特征。CellChat和虚拟敲除分析提供了机制线索，即这些基因可能通过影响细胞通讯和氧化应激、铁死亡、ECM重塑等通路参与放疗抵抗。实验验证进一步支持了计算预测，表明这四个基因不仅是预后标志物，还功能性维持恶性细胞的放疗抵抗行为。研究局限性包括依赖公共数据集、有限的IHC队列、基于SCC9的体外验证以及部分机制推断，需进一步大样本验证和体内研究。
**结论**：综上所述，本研究通过整合单细胞和bulk转录组分析，在OSCC中鉴定了一个由KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B组成的放疗相关四基因标志物。该标志物具有预后价值，并与恶性细胞异质性、免疫重塑、细胞间通讯和应激相关通路密切相关。组织和细胞验证进一步证实这些基因在放疗抵抗OSCC中上调，且其敲低增强了SCC9细胞的放射敏感性。这些发现表明KPNA2、P4HA1、ARL6IP1和TUBA1B可作为克服OSCC放疗抵抗的潜在生物标志物和治疗靶点。
