mTORC1激活诱导肾细胞癌中B7-H3依赖的代谢重编程

《Oncogene》：mTORC1 activation induces B7-H3-dependent metabolic reprogramming in renal cell carcinoma (RCC)

　　

肾细胞癌（RCC）每年影响全球超过435,000人，并仍是癌症死亡的重要原因。mTORC1等通路的异常激活在RCC中常见，但mTORC1促进肿瘤发展的机制仍知之甚少。缺乏合适的动物模型限制了揭示这些机制和推进靶向治疗的进展。在此，研究人员对胚胎期E17.5进行Tsc2缺失的小鼠肾脏进行了单细胞转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析，发现了一个独特的肿瘤细胞群体，其特征为插入细胞标志、Foxi1和Rhcg共表达以及mTORC1过度激活。这些病变与人类染色体肾细胞癌（ChRCC）——RCC的一个亚型——高度相似。肿瘤中免疫检查点分子B7-H3显著上调。机制上，转录因子NRF1在Tsc2缺陷病变中升高，并驱动肿瘤细胞中B7-H3的表达。在人类样本中，B7-H3在经典型和肉瘤样ChRCC中广泛表达，并与标志物FOXI1、MUC2和HEPACAM2相关。引人注目的是，小鼠中B7-H3缺失抑制了Tsc2缺失驱动的囊肿和肿瘤形成，恢复了氨基酸代谢，并减弱了氨基酰-tRNA生物合成和蛋白酶体活性。总之，这些发现将B7-H3确定为Tsc2介导的ChRCC的功能驱动因子，并作为TSC相关肾肿瘤的一个有前景的治疗靶点。

**论文解读：mTORC1激活通过B7-H3依赖的代谢重编程驱动肾细胞癌发生**

**研究背景与科学问题**

肾细胞癌（RCC）是全球发病率居前的恶性肿瘤，每年新发病例超过43.5万，其中染色体肾细胞癌（ChRCC）是第三常见亚型，但其发病机制尚不明确。mTORC1信号通路的异常激活在RCC中频繁出现，尤其与TSC1/TSC2基因突变相关的结节性硬化症（TSC）综合征中，约5%的患者会发展为ChRCC或混合性嗜酸细胞-染色体肾肿瘤（HOCT）。然而，此前报道的TSC敲除小鼠模型仅形成肾囊肿和囊腺瘤，未能重现ChRCC，这严重制约了机制研究和靶向治疗的进展。同时，免疫检查点分子B7-H3（CD276）在多种肿瘤中高表达，已知其通过抑制CD8⁺T细胞等免疫细胞功能促进免疫逃逸，并参与非免疫性调控如脂质代谢和HIF-1α稳定化，但其在ChRCC中的表达模式、调控机制及对代谢和蛋白质稳态的影响尚不清楚。因此，构建能够模拟人类ChRCC的可靠动物模型，并阐明mTORC1下游效应分子B7-H3在肿瘤发生中的作用，是当前研究的关键问题。

**研究内容与核心结论**

研究人员通过条件性敲除Tsc2基因（胚胎期E17.5给药他莫昔芬）建立了新型小鼠模型，发现该模型小鼠肾脏出现多系统异常，包括囊肿、乳头状囊腺瘤和类似人类ChRCC的实体瘤，且50%小鼠在约165天内死亡。单细胞转录组学分析揭示了由A型插入细胞（IC-A）起源的囊肿/肿瘤细胞群体，其高表达插入细胞标志物（Foxi1、Rhcg）并呈现mTORC1过度激活。进一步亚群分析发现，这些细胞中有一个簇（Cluster 1）高表达ChRCC标志基因FOXI1、HEPACAM2和MUC20，且与人类ChRCC转录组特征高度一致。值得注意的是，B7-H3在肿瘤细胞中显著上调，且其表达受转录因子NRF1的转录调控。在人类ChRCC标本（32例经典型和11例肉瘤样型）中，B7-H3广泛表达并与FOXI1、MUC20、HEPACAM2相关。通过构建Tsc2和B7-H3双敲除（dKO）小鼠，研究人员发现B7-H3缺失显著抑制了囊肿和实体瘤的形成，改善了肾功能，并降低了增殖指数（Ki-67）和凋亡（TUNEL）。整合代谢组学和蛋白质组学分析显示，B7-H3缺失逆转了Tsc2缺失引起的多种氨基酸（如赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等）水平升高，并下调了多个氨基酰-tRNA合成酶（如VARS1、QARS1）以及tRNA充电水平，同时减弱了NRF1依赖的蛋白酶体亚基（PSMD14、PSMA3）表达。该研究发表在《Oncogene》上，明确了B7-H3作为Tsc2介导的ChRCC功能驱动因子和潜在治疗靶点。

**关键技术方法（不超过250字）**

研究人员采用了以下主要技术：①基因工程小鼠模型：利用Rosa26-CreERT2、Tsc2^flox/flox和Cd276^?/?小鼠系，通过他莫昔芬诱导胚胎期条件性敲除，构建Tsc2单敲除和Tsc2/B7-H3双敲除模型；②单细胞RNA测序（scRNA-seq）：对24周龄小鼠肾脏进行高通量转录组分析，使用RPCA整合去除批次效应，结合Slingshot和Monocle 3进行伪时间轨迹分析；③靶向代谢组学：质谱法检测300种极性代谢物，并进行代谢物集富集分析（MSEA）；④全局蛋白质组学：对肾脏组织进行蛋白质组定量；⑤免疫组化（IHC）、免疫印迹、qRT-PCR及荧光素酶报告基因实验；⑥tRNA充电分析。人类ChRCC标本来自四川大学华西医院（32例经典型、11例肉瘤样型），所有动物实验经浙江大学和布里格姆妇女医院机构动物护理和使用委员会批准，人体研究经华西医院伦理委员会批准并取得患者知情同意。

**研究结果**

**1. 条件性胚胎TSC2敲除导致多系统异常，包括肾囊肿和实体瘤**
研究人员通过组织学分析发现，TSC2敲除小鼠肾脏出现囊肿、乳头状囊腺瘤和类似ChRCC的实体瘤（大细胞、淡染胞质、核周空晕），平均每张切片含122个囊肿、2个乳头和18个实体瘤。免疫组化显示这些病变中mTORC1活性（pS6^S235/236）升高，实体瘤还表达间质标志物波形蛋白（vimentin）。小鼠还出现肺气肿、脾肿大和足部血管肉瘤，生存期显著缩短。

**2. Tsc2缺失驱动囊肿/肿瘤形成源于A型插入细胞系**
通过scRNA-seq（各3只WT和TSC2 KO小鼠，共53,356个细胞），研究人员鉴定出14种细胞类型，其中囊肿/肿瘤细胞仅存在于TSC2 KO组，占45%，并高表达插入细胞标志物（Atp6v1g3、Aqp6、Rhcg、Slc4a1）。机器学习模型（glmnet）和伪时间分析（Slingshot、Monocle 3）均表明囊肿/肿瘤细胞起源于A型插入细胞（IC-A），且远端小管细胞也可能贡献。

**3. TSC2小鼠肾肿瘤与人类ChRCC相似**
囊肿/肿瘤细胞亚群分析显示，Cluster 1高表达ChRCC标志基因（Foxi1、Hepacam2、Muc20），并富集人类ChRCC基因特征，同时具有高mTORC1活性评分。免疫组化证实TSC2 KO小鼠肾肿瘤和人类ChRCC均表达FOXI1、HEPACAM2、MUC20。此外，囊肿/肿瘤细胞中存在L1cam⁺和Foxi1⁺两个互斥的细胞群体，类似于BHD综合征相关HOCT中的细胞分化模式。

**4. B7-H3在人类ChRCC中高表达，B7-H3缺失挽救TSC2 KO小鼠的囊肿和肿瘤形成**
scRNA-seq显示B7-H3（Cd276）在囊肿/肿瘤细胞中表达最高，免疫组化和免疫印迹证实其在TSC2 KO肾脏中上调。在人类ChRCC中，B7-H3在经典型和肉瘤样型中均表达，并与MUC20、HEPACAM2正相关。B7-H3全敲除后，TSC2 B7-H3 dKO小鼠囊肿数量减少60%，无乳头状或实体瘤，肾体比、肾功能（血尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白）均恢复正常，且Ki-67和TUNEL阳性细胞减少。scRNA-seq显示囊肿/肿瘤细胞比例降低，但转录组变化极小。

**5. B7-H3缺失减弱Tsc2缺失驱动的氨基酸和氨基酰-tRNA生物合成增强**
代谢组学主成分分析显示TSC2 KO肾脏代谢谱显著偏离WT，而B7-H3缺失后代谢谱回归至接近WT和B7-H3 KO。MSEA鉴定出嘌呤代谢和氨基酰-tRNA生物合成最显著下调。多种氨基酸（赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等）在TSC2 KO中升高，在dKO中恢复。蛋白质组学发现多个氨基酰-tRNA合成酶（VARS1、QARS1、NARS1等）在TSC2 KO中上调，在dKO中下调。tRNA充电实验证实tRNA^ValMAC和tRNA^GluMAC充电水平在TSC2 KO中升高，在dKO中降低。

**6. NRF1-B7-H3轴调控TSC2 KO肾脏中的蛋白酶体通路**
JASPAR预测和ENCODE ChIP-seq数据表明NRF1结合B7-H3启动子。在Tsc2缺陷细胞系（105K、705K）中，NRF1 siRNA敲低减少B7-H3 mRNA和蛋白表达，并抑制CD276启动子活性>50%。B7-H3敲低也降低NRF1蛋白水平，提示存在反馈环路。免疫组化和免疫印迹显示TSC2 KO肾脏中NRF1、PSMD14、PSMA3上调，而dKO中恢复。RNA-seq和蛋白质组学也证实蛋白酶体亚基在TSC2 KO中上调，B7-H3缺失后减弱。此外，NRF1或B7-H3敲低增加磷酸化AMPKα^Thr172并降低pS6^S240/244，提示mTORC1活性下降。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究通过条件性胚胎期Tsc2敲除首次建立了类似人类ChRCC的小鼠模型，并证实A型插入细胞是ChRCC的起源细胞。囊肿/肿瘤细胞中Foxi1⁺Rhcg⁺亚群具有强mTORC1信号，可能代表更具侵袭性的细胞群体。B7-H3在ChRCC中高表达，且其缺失不改变囊肿/肿瘤细胞的转录组，也不影响T细胞，因此主要通过非免疫途径（即代谢重编程）促进肿瘤发生。具体而言，B7-H3缺失通过下调NRF1-蛋白酶体轴和氨基酰-tRNA合成，减少氨基酸供应和蛋白质合成，从而抑制mTORC1活性并减轻肿瘤表型。研究结论翻译如下：总之，研究人员通过条件性Tsc2缺失开发了一种新的TSC相关ChRCC小鼠模型。单细胞转录组学鉴定出一个独特的A型插入细胞来源的肿瘤群体，具有过度活跃的mTORC1信号。重要的是，B7-H3缺失通过破坏氨基酸代谢和氨基酰-tRNA生物合成抑制了TSC2缺陷的肿瘤发生，凸显了B7-H3作为潜在治疗靶点，并为TSC相关肾肿瘤的精准干预提供了机制基础。