双靶向药理学UFMylation（泛素折叠修饰1）抑制重编程肿瘤与免疫微环境以实现胶质母细胞瘤长期消退

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Dual-targeting pharmacological UFMylation inhibition reprograms tumor and immune microenvironments to achieve long-term glioblastoma regression

　　

UFMylation是一种新近发现的类泛素（ubiquitin-like）修饰，对细胞应激稳态至关重要，尤其在内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激调控中发挥作用。然而，由于缺乏强效小分子抑制剂，其生物学与治疗学探索一直受阻。在此，研究人员报道了首个靶向UFMylation E3连接酶复合物核心蛋白DDRGK1的两个化合物发现：Osimertinib（最初设计为EGFR T790M选择性抑制剂，通过此前未被识别的共价机制起作用）和CP-24（一种新型非共价抑制剂）。两个化合物均破坏DDRGK1–UFL1相互作用，全局抑制UFMylation，抑制ER-自噬（ER-phagy），并诱导ER应激。在胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）中，药理学UFMylation抑制显著降低肿瘤细胞活力，并使细胞对替莫唑胺（Temozolomide）与放疗增敏。两个化合物还具有强免疫调节活性，促进巨噬细胞向抗肿瘤M1状态极化。在体内，Osimertinib凭借更优的药代动力学特征，在免疫缺陷模型中显著抑制肿瘤生长，并在65%的免疫健全小鼠中实现无肿瘤结局。这些无肿瘤小鼠形成持久的抗炎GBM免疫记忆，在再次攻击时迅速清除肿瘤，这是既往GBM治疗无法实现的结局。机制上，Osimertinib通过促进巨噬细胞M1极化、T细胞扩增以及降低PD-1蛋白水平来增强抗肿瘤免疫。综上，研究人员的研究将Osimertinib和CP-24引入作为解析UFMylation生物学的宝贵化学探针，并强调Osimertinib在EGFR野生型GBM中超说明书使用的潜力。更广泛地，研究人员确立UFMylation抑制作为一种双靶向治疗策略，可同时破坏肿瘤生存通路并重编程免疫微环境，为GBM持久控制提供有前景的途径。

研究背景方面，UFMylation作为类泛素修饰，通过E1（UBA5）、E2（UFC1）、E3（UFL1–DDRGK1–CDK5RAP3）级联催化UFM1与底物结合，维持内质网应激与ER?phagy等蛋白稳态，但其缺乏高效特异性小分子抑制剂限制了功能与治疗研究。胶质母细胞瘤（GBM）五年生存率低于3%，标准手术、放疗、替莫唑胺（TMZ）、肿瘤治疗电场疗效有限且易耐药，亟需新策略。遗传学提示UFMylation组分（UBA5、UFC1、UFL1）参与GBM存活、放化疗抵抗与免疫逃逸，具促癌属性，药理学靶向具潜力。本研究由研究人员开展，旨在发现靶向DDRGK1–UFL1互作的抑制剂，验证Osimertinib与CP?24在GBM中对UFMylation的抑制、抗肿瘤与免疫重编程效应，并探明机制与在体疗效。结论表明两化合物通过结合DDRGK1破坏E3组装，抑制全局UFMylation、阻断ER?phagy、诱导ER应激，在体外杀伤GBM并增敏TMZ与放疗，促进巨噬细胞M1极化；Osimertinib在免疫健全小鼠实现约65%完全消退与长期免疫记忆，机制含M1极化、T细胞扩增与PD?1下调。意义在于首次将已上市Osimertinib重新界定为UFMylation抑制剂，为EGFR野生型GBM提供可快速转化的超说明书思路，并将UFMylation抑制确立为同时靶向肿瘤与免疫的双靶向策略，论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

关键方法上，研究人员采用基于NanoBRET的高通量筛选联合Schr?dinger Maestro虚拟筛选从化合物库鉴定DDRGK1–UFL1互作抑制剂；通过等温滴定量热（ITC）、共免疫沉淀（co?IP）、Q?TOF MS与分子对接验证结合与共价修饰位点；在A172、LN229、U251、U87细胞及GBM322等患者来源细胞评估UFMylation、ER?phagy（mCherry?EGFP?RAMP4系统）、ER应激（bulk RNA?seq）、细胞死亡与TMZ/放疗增敏；用THP?1来源与原代骨髓巨噬细胞检测M1极化；在NCG小鼠U87原位、BALB/c裸鼠GBM375患者来源异种移植、C57BL/6J小鼠GL261同基因模型中口服Osimertinib（10 mg/kg）评估肿瘤负荷（生物发光成像）、生存与免疫表型（流式细胞术分选肿瘤浸润CD45⁺免疫细胞），并进行28周后肿瘤再攻击实验评估免疫记忆；转录数据分析采用CGGA、GEPIA、TCGA队列与DepMap药物敏感性数据。

研究结果部分，Identification of Osimertinib and CP?24 as potent disruptors of the DDRGK1?UFL1 interaction：研究人员构建NanoBRET体系筛选并虚拟富集，发现Osimertinib与CP?24剂量依赖性抑制DDRGK1?UFL1蛋白?蛋白相互作用（PPI），被选为候选抑制剂。Binding of Osimertinib and CP?24 to DDRGK1：ITC显示两化合物直接结合DDRGK1^Δ216–314而不结合UFL1^Δ1–212，预孵育后抑制DDRGK1^Δ216–314与UFL1^Δ1–212结合；co?IP证实细胞内降低DDRGK1?UFL1共沉淀；MS显示Osimertinib共价修饰DDRGK1^Δ216–314的Ser226、Lys227、Thr217，CP?24为非共价结合；分子对接阐明各自结合模式，共价结合解释更强NanoBRET抑制。Impact on UFMylation and ER stress induction：在多株GBM细胞中，两化合物剂量依赖性降低全局UFM1偶联蛋白与DDRGK1蛋白水平；mCherry?EGFP?RAMP4系统显示抑制饥饿诱导ER?phagy；共表达dTomato?DDRGK1与EGFP?UFL1可见聚集体减小并出现内质网涡旋样结构（ER whorl?like structures）；RNA?seq与qRT?PCR显示HSPA5、sXBP1、ERN1、EIF2AK3、CANX、ATF4、DDIT3等ER应激基因上调；其他EGFR/MNK2抑制剂不重现上述效应，表明作用不依赖已知靶点。Pleiotropic anti?tumor effects in vitro：CGGA、GEPIA、TCGA显示DDRGK1高表达与GBM患者生存负相关且与WHO分级、年龄正相关；shRNA敲低DDRGK1/UFL1抑制增殖，过表达促进；两化合物剂量依赖性降低GBM细胞系与患者来源细胞活力，DDRGK1过表达挽救死亡；RNA?seq示凋亡基因（CASP1、CASP4、CASP8、CASP9、CASP10、BAX、TP53、PTEN、FAS）上调，增殖基因（KI67、CCND1、CCND2、CCND3、CDK2、CDK6、CDK10、CDK15、MTOR）下调；EGFRvIII表达不挽救死亡，磷酸化EGFR Y1068抑制与死亡无对应，DepMap显示敏感度关联DDRGK1而非EGFR/MKNK2；TMZ耐药与放疗后细胞对两化合物更敏感，RNA?seq示DNA修复基因（ATR、RAD51、DDB1、DDB1、CHEK1、MSH2、PCNA、RPA1、SMC3、DCLRE1B）下调；两化合物在THP?1与原代骨髓巨噬细胞中上调M1标记（CD68、CD86、CD80、ITGAX、CXCL16），不改M2（TGFB1）。Pleiotropic anti?tumor effects in vivo：药代显示Osimertinib脑暴露优于CP?24；在NCG U87原位与BALB/c裸鼠GBM375模型，口服10 mg/kg Osimertinib显著降低肿瘤负荷并延长生存且无体重影响；在C57BL/6J GL261同基因模型，约65%小鼠完全消退，10/14长期无瘤；流式示外周血与肿瘤浸润中CD80⁺髓系细胞（M1）增加，CD3⁺CD4⁺ T细胞增多，肿瘤浸润CD3⁺CD8⁺与CD3⁺CD4⁺ T细胞PD?1蛋白水平下降；免疫印迹示肿瘤细胞和各类免疫细胞中全局UFMylation均被抑制。Long?term immune memory and prevention of glioblastoma recurrence：28周后在初始对侧再接种GL261?luc，曾无瘤小鼠6日内无进展，14日内完全清除；再攻击2日后CD8⁺CD44⁺CD62L^?效应T、CD8⁺CD44⁺CD62L⁺中央记忆T、CD4⁺CD44⁺CD62L^?效应T扩张，CD8⁺CD44^?CD62L⁺与CD4⁺CD44^?CD62L⁺初始T减少，证明持久免疫记忆防复发。

讨论部分总结：研究人员讨论中指出，Osimertinib与CP?24通过靶向DDRGK1?UFL1抑制UFMylation，在GBM中兼具直接致死、ER应激、免疫重编程（M1极化、T细胞扩增、PD?1下调）与长期免疫记忆，65%免疫健全小鼠完全消退为既往疗法未及；Osimertinib在EGFR野生型GBM中通过共价结合DDRGK1起效，独立于突变EGFR抑制，提示可拓展至更广GBM人群超说明书使用；CP?24需优化药代与脑渗透；GBM异质性决定单药难持久，但两化合物增敏TMZ/放疗并降PD?1，可联合标准治疗与免疫检查点阻断，并以DDRGK1表达与IDH状态分层；不能完全排除微量脱靶与EGFR协同，需全景蛋白质组排查；总体而言，研究确立UFMylation驱动GBM进展，抑制其为双靶向策略，并为已上市药再定位与新一类UFMylation导向治疗奠基。研究结论部分译为：在本研究中，研究人员将Osimertinib和CP?24鉴定为靶向DDRGK1?UFL1相互作用的有效UFMylation抑制剂。两化合物抑制全局UFMylation，降低DDRGK1蛋白水平，损害ER?phagy，诱导深度ER应激，触发肿瘤细胞死亡并调节免疫反应。在原位模型中，Osimertinib在免疫缺陷宿主中显著抑制肿瘤生长，并在65%免疫健全小鼠中实现完全、持久消退——伴随再攻击时强健的抗GBM免疫记忆，这是先前治疗无法达成的。这反映双靶向机制：通过ER应激诱导凋亡直接杀瘤，以及强效重编程免疫微环境（包括M1巨噬细胞极化、T细胞扩增、肿瘤浸润T细胞PD?1下调），将免疫“冷”GBM转为活跃病灶。值得注意的是，Osimertinib通过此前未被识别的靶向DDRGK1的共价机制在EGFR?WT GBM中发挥这些效应，独立于其对突变EGFR的经典活性。然而迄今为止，Osimertinib在GBM中的临床评估主要限于EGFR突变背景。鉴于其抑制UFMylation、降低与生存负相关的DDRGK1、诱导ER应激并同时调控肿瘤细胞死亡与免疫微环境，Osimertinib成为包括EGFR?WT在内、缺乏有效靶向治疗的更广大GBM患者再定位的有前景候选；因此该治疗假说值得前瞻性、生物标志物指导的临床研究。尽管CP?24在体外有效，但其药代需进一步优化以提升潜力，仍可作为有价值化学探针与非共价UFMylation抑制剂新骨架。GBM仍极难治愈，尚无单药实现持久生存获益；其遗传、表观与环境异质性驱动快速适应耐药与克隆选择，Osimertinib虽在模型中有效但单药不大可能克服所有障碍。数据提示可联合TMZ与放疗（两化合物增敏、下调DNA修复、降PD?1），并以DDRGK1表达与IDH状态分层，采用适应性设计与治疗中活检监测耐药。虽数据支持UFMylation抑制为Osimertinib抗GBM核心驱动，但不能完全排除其他解释：其在微摩尔浓度下报道有微弱脱靶激酶（如MNK2）抑制，但对应选择性抑制剂不重现UFMylation抑制与细胞毒，且敏感度不与已知靶点转录相关，提示贡献微小；GBM细胞或对EGFR信号与UFMylation具双重依赖，不能排除EGFR抑制与UFMylation抑制协同可能；共价弹头或与DDRGK1外亲核残基反应，需全面无偏蛋白质组界定潜在脱靶以优化剂量与安全转化。这些可能不削弱UFMylation抑制为GBM可行动脆弱性的核心结论，但凸显第二代非共价抑制剂（如CP?24衍生物）与目标去卷积研究对未来临床转化特异性的价值。综上，结果确立UFMylation在推动GBM进展中的关键作用，并强调UFMylation抑制为同时影响肿瘤与免疫应答的双靶向策略；通过揭示已上市药物在占多数的EGFR?WT亚型中强效、EGFR非依赖活性，本工作提供即时再定位机会，并为新型UFMylation导向治疗奠定基础。