沙眼衣原体D血清型在无显著炎症的情况下在尿道上皮T24/83细胞中复制

《Scientific Reports》：Chlamydia trachomatis serovar D replicates in uroepithelial T24/83 cells in the absence of overt inflammation

　　

人尿道上皮膀胱癌细胞系T24/83高效复制沙眼衣原体（C. trachomatis）D血清型。研究人员在此表明，该病原体感染诱导了细胞因子基因如il1_β、il6和tnf的显著转录，但未诱导其分泌。受感染的HeLa细胞除IL-6外也不释放这些细胞因子。相比之下，内毒素、转染的polyI:C或尿路致病性大肠杆菌（E. coli）菌株CFT073感染在T24/83细胞中诱导了强烈的促炎反应。这些发现表明，细胞识别病原体相关分子模式（PAMPs），包括Toll样受体4（TLR4）和Toll样受体3（TLR3）的配体——内毒素和双链RNA（dsRNA），后者也存在于沙眼衣原体D血清型中。因此，研究人员生成了tlr4缺陷的T24/83细胞，以研究其对沙眼衣原体D血清型复制的影响。与预期相反，沙眼衣原体D血清型在T24/83细胞中的复制并未因tlr4缺陷而获益。据报道，TLR3在人输卵管细胞系OE-E6/E7中识别沙眼衣原体D血清型。然而，tlr3缺陷也未改善该病原体在T24/83细胞中的复制。有趣的是，沙眼衣原体D血清型并未调节内毒素诱导的细胞因子释放，但显著损害了polyI:C诱导且TLR3依赖的IFN-β释放。研究人员得出结论，沙眼衣原体D血清型避免了炎症反应，并绕过了受感染的尿道上皮T24/83细胞中TLR4和TLR3的识别。

**沙眼衣原体D血清型在尿道上皮细胞中无炎症复制的机制研究解读**

**研究背景与问题**

沙眼衣原体（*Chlamydia trachomatis*）D-K血清型是性传播感染的主要病原体之一，全球每年新增病例超过1.31亿例。感染女性后可能导致输卵管积水、宫外孕、不孕或盆腔炎性疾病，这些严重并发症通常被认为与泌尿生殖道细胞持续性的炎症反应有关。然而，临床上许多感染病例是无症状的，提示该病原体可能具备逃避宿主炎症反应的能力。上皮细胞（如尿道或生殖道上皮）是沙眼衣原体D-K血清型的主要靶细胞，支持其独特的双相发育周期。感染是否引发症状取决于是否触发炎症，而炎症的启动需依赖上皮细胞中模式识别受体（PRRs）如Toll样受体（TLRs）对病原体相关分子模式（PAMPs）的识别。既往研究显示，沙眼衣原体感染可诱导上皮细胞中促炎细胞因子基因的转录，但蛋白质水平的分泌情况存在矛盾（例如Tang等人在原代宫颈细胞中发现转录升高但未检测蛋白分泌；另有研究需72小时才能检测到IL-1α）。此外，不同血清型（如L2与D）及不同细胞系（如输卵管细胞系OE-E6/E7）对炎症反应的贡献差异显著。为厘清沙眼衣原体D血清型是否能在不引发炎症的情况下高效复制，研究人员选取了人膀胱癌细胞系T24/83作为模型，因其能高效复制该病原体，表达多种PRRs（包括TLR4、TLR3、MyD88、cGAS/STING），并对细菌PAMPs及尿路致病性大肠杆菌（*E. coli*）CFT073感染产生强烈的促炎细胞因子分泌。本研究旨在探究沙眼衣原体D血清在T24/83细胞中的促炎反应特征，以及TLR4和TLR3在其中的作用。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术：1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别靶向TLR4外显子2和4以及TLR3跨膜区，构建tlr4缺陷和tlr3缺陷的T24/83细胞株，并通过限制性分析、PCR及测序验证突变，再通过细胞因子分泌实验（LPS刺激检测TLR4功能，IFN-γ预处理后polyI:C/Dotap转染检测TLR3功能）确认缺陷表型。2）通过微阵列（HuGene-2_0-st-type芯片）分析感染（沙眼衣原体D血清型，MOI 5）或刺激（LPS、polyI:C/脂质体）4小时和24小时后的全转录组，筛选显著差异表达的促炎基因，并采用RMA背景校正和分位数归一化，ANOVA结合FDR校正进行统计。3）使用反转录实时定量PCR（RT-qPCR）验证关键基因（*tnf*、*il6*、*il1β*、*irak2*、*ifi44l*、*ifit2*）的转录水平。4）通过ELISA检测培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-β的蛋白水平。5）采用Western blot检测IRF3磷酸化（Ser386、Ser396）和IκB降解以评估NF-κB和IRF3信号通路激活。6）利用荧光显微镜和抗衣原体多表位FITC偶联抗体染色，计数包涵体数量并测量面积，评估TLR缺陷对衣原体复制的影响。所有细胞系（T24/83和HeLa）均培养于含10% FCS、庆大霉素和万古霉素的培养基中，沙眼衣原体D血清型在HeLa细胞中扩增，UPE菌株CFT073在LB培养基中培养。

**研究结果**

**1. 尿道上皮细胞系T24/83感染沙眼衣原体D血清型后的转录促炎反应**
通过微阵列分析，研究人员发现感染4小时后，T24/83细胞中显著诱导了*TNF-α*、*IL-6*等促炎基因的转录，但诱导强度远低于LPS或polyI:C/脂质体刺激。24小时后，干扰素相关基因成为主导，但整体转录水平仍较弱。与LPS或polyI:C诱导的基因表达谱相比，沙眼衣原体D血清型诱导的基因模式差异显著，且上调倍数偏低。

**2. 沙眼衣原体D血清型感染不激活促炎信号级联**
Western blot结果显示，感染T24/83和HeLa细胞4小时后，未检测到IRF3（Ser386和Ser396）磷酸化或IκB降解，提示NF-κB和IRF3通路未被激活。ELISA进一步证实，感染后T24/83细胞未分泌IFN-β、IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α，HeLa细胞除IL-6外也未分泌。相比之下，LPS刺激T24/83细胞可诱导IL-6、IL-8、TNF-α分泌，polyI:C/脂质体转染可诱导IFN-β分泌；尿路致病性大肠杆菌CFT073感染亦能诱导T24/83细胞分泌IL-6和TNF-α。

**3. 沙眼衣原体D血清型诱导的转录组不同于内毒素或polyI:C诱导的基因表达模式**
分析感染4小时最显著上调的基因，发现*MMP1*、*MMP3*、*HTN1*、*KRTAP4-12*、*HTN3*等基因表达最强，其中*HTN1*和*HTN3*在24小时仍保持高表达，同时出现干扰素诱导基因。这些基因在LPS或polyI:C刺激下几乎不诱导或弱诱导，表明沙眼衣原体D血清型触发的识别后果与典型PAMPs存在本质差异。

**4. 沙眼衣原体D血清型包涵体在tlr4或tlr3缺陷T24/83细胞中的发育**
利用CRISPR/Cas9成功构建了tlr4缺陷和tlr3缺陷T24/83细胞株，并验证了其功能缺陷（tlr4缺陷细胞对LPS无IL-6分泌；tlr3缺陷细胞经IFN-γ预处理后对polyI:C/Dotap的IFN-β分泌显著降低）。感染沙眼衣原体D血清型后，tlr4缺陷细胞中包涵体面积显著小于野生型，而感染细胞百分比无差异；将子代衣原体传代至新鲜细胞后，tlr4缺陷细胞中感染细胞百分比和包涵体面积均显著减小。交叉传代实验显示，TLR4信号可能调节衣原体复制但非控制。tlr3缺陷对感染细胞百分比、包涵体面积及子代传代均无显著影响。然而，沙眼衣原体D血清型感染48小时后显著抑制了polyI:C/Dotap诱导的TLR3依赖性IFN-β分泌。

**总结与讨论**

本研究证实，沙眼衣原体D血清型感染人膀胱癌细胞系T24/83后，仅诱导微弱的促炎基因转录，不足以产生可检测的细胞因子蛋白分泌，且不激活NF-κB和IRF3信号通路。T24/83细胞对LPS、polyI:C及尿路致病性大肠杆菌CFT073均能产生强烈促炎反应，表明其具备完整的PAMPs识别能力，但沙眼衣原体D血清型成功规避了这种识别。尽管TLR4和TLR3在T24/83细胞中功能完备，但两者均未参与沙眼衣原体D血清型诱导的炎症反应，也不显著影响病原体的复制。有趣的是，TLR4和TLR3在一定程度上抑制了某些促炎基因（如*tnf*、*il1β*、*irak2*、*ifi44l*、*ifit2*）的转录，而沙眼衣原体D血清型则选择性地损害了TLR3依赖的IFN-β分泌（通过polyI:C/Dotap途径），但对TLR4依赖的LPS诱导细胞因子释放无影响。这些发现表明，沙眼衣原体D血清型通过一种尚未明确的机制主动抑制TLR3信号，同时避免被TLR4识别，从而实现无炎症的细胞内复制。研究结果支持了沙眼衣原体D血清型感染常无症状的临床观察，并提示不同组织来源的上皮细胞对同一血清型的炎症反应存在差异（如本研究中T24/83细胞与既往报道中输卵管细胞OE-E6/E7的TLR3依赖性反应不同）。本研究的局限性在于使用了膀胱癌细胞系而非原代生殖道上皮细胞，未来需在永生化或原代人生殖道上皮细胞中验证。

**结论**：研究人员得出结论，沙眼衣原体D血清型避免了炎症反应，并绕过了受感染的尿道上皮T24/83细胞中TLR4和TLR3的识别。本研究显示，沙眼衣原体D血清型感染人尿道上皮细胞系T24/83仅触发微弱的转录促炎反应，不足以分泌促炎细胞因子。此外，研究人员未发现TLR4或TLR3影响沙眼衣原体D血清型在T24/83细胞中复制的证据，这与在其他上皮细胞中的观察结果相反。本研究揭示的沙眼衣原体D血清型较低的促炎潜力可能有助于解释生殖道沙眼衣原体D-K血清型感染常呈无症状进展的临床现象。