《Nature Communications》：Histone Acetylation Differentially Modulates CTCF-CTCF Loops and Intra-TAD Interactions
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黏连蛋白复合体通过挤压环和组织拓扑关联结构域（TADs）来构建人类细胞间期基因组，然而染色质状态如何调控黏连蛋白-染色质相互作用仍不清楚。研究人员在这里表明，由曲古抑菌素A（TSA）诱导的组蛋白过度乙酰化选择性破坏短程TAD内部相互作用，同时基本保留CTCF锚
黏连蛋白复合体通过挤压环和组织拓扑关联结构域（TADs）来构建人类细胞间期基因组，然而染色质状态如何调控黏连蛋白-染色质相互作用仍不清楚。研究人员在这里表明，由曲古抑菌素A（TSA）诱导的组蛋白过度乙酰化选择性破坏短程TAD内部相互作用，同时基本保留CTCF锚定的环。这些不同的响应定义了两种功能性黏连蛋白群体：与动态环挤压相关的TSA敏感群体，以及通过拓扑包埋在CTCF位点维持的TSA抵抗群体。利用具有TEV可切割RAD21的半体外系统，研究人员证明过度乙酰化增加了CTCF锚定环对黏连蛋白环切割的敏感性，支持其稳定性的拓扑基础。研究人员进一步在CTCF位点鉴定出一个TSA敏感的黏连蛋白部分，表明存在瞬时的、非环绕的中间体。总之，研究人员的发现揭示了黏连蛋白以不同的生化状态存在，差异调控染色质环稳定性和对表观基因组扰动的响应性。
**论文解读**
**研究背景、问题与意义**
真核生物基因组的三维（3D）结构对基因表达调控至关重要。黏连蛋白复合体（cohesin complex）通过环挤压（loop extrusion）形成染色质环，并组织拓扑关联结构域（topologically associating domains, TADs）。CTCF位点以方向依赖性方式阻断黏连蛋白介导的环挤压，形成稳定的CTCF-CTCF环。已有研究表明，黏连蛋白在CTCF位点以拓扑方式（chromatin encircling）结合染色质，维持环的稳定性；而在TAD内部，黏连蛋白则通过非拓扑的“夹持”模式（clamping）参与动态环挤压。然而，染色质修饰（如组蛋白乙酰化）如何调控黏连蛋白-染色质相互作用，进而影响染色质环的动态与稳定性，尚不清楚。组蛋白过度乙酰化已知可降低核小体相互作用、促进染色质开放，但其对黏连蛋白介导的染色质环的影响缺乏系统研究。本研究旨在揭示组蛋白乙酰化对两类黏连蛋白环（CTCF-CTCF环与TAD内部环）的差异性调控机制，为理解表观基因组扰动下3D基因组组织的分子基础提供新见解。该论文发表在《Nature Communications》。
**主要技术方法**
研究采用HAP1细胞系及其衍生HAP1-RAD21
TEV细胞（含TEV可切割RAD21），以及HCT-116-mAID-RAD21降解细胞系。主要技术包括：Hi-C（染色质构象捕获测序）分析整体染色质相互作用；ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）检测CTCF和黏连蛋白亚基结合；ChIP-loop和PLAC-seq（靶向捕获黏连蛋白介导的相互作用）；半体外核体系（semi-in vitro nuclear system）结合TEV蛋白酶切割，解析黏连蛋白的拓扑结合状态；Western blot评估蛋白质结合水平；流式细胞术确保细胞周期一致性。短时（3小时）低浓度（500 nM）曲古抑菌素A（TSA）处理诱导组蛋白过度乙酰化，避免长时间处理的混杂效应。
**研究结果**
**TSA诱导的组蛋白过度乙酰化对基因组区室化的影响**
Hi-C分析显示，TSA处理增加了A区室（compartment）bin的数量，但未显著改变区室间相互作用强度（A-A或B-B偏好性），表明组蛋白乙酰化轻度影响区室模式，但整体区室化结构得以维持。
**TSA诱导的组蛋白乙酰化减少局部染色质相互作用**
TSA处理后，Hi-C接触图谱显示TAD内部相互作用降低，TAD边界绝缘强度减弱。通过绘制接触频率随距离变化曲线（P(s)）及其导数，发现短程（<2 Mb）相互作用减少约20%，提示局部染色质相互作用被削弱。
**组蛋白过度乙酰化减少黏连蛋白介导的环**
P(s)导数图显示黏连蛋白环特征峰（~100 kb处）改变，表明环的数量减少、尺寸略有增加。针对CTCF-CTCF环的聚合分析（aggregate pileup）显示，TSA处理对其强度影响甚微。而TAD内部平均相互作用频率显著降低。利用RAD21降解细胞去除黏连蛋白后，TSA仍能进一步降低TAD内部相互作用，表明约50%的减少归因于黏连蛋白介导的环丢失，其余源于染色质解压缩导致的构象变化。ChIP-loop和PLAC-seq实验进一步证实，TSA处理后黏连蛋白环信号在TAD内部显著降低，而CTCF-CTCF环保持稳定。
**组蛋白过度乙酰化对黏连蛋白和CTCF染色质结合的影响**
Western blot显示，TSA处理未改变黏连蛋白核心亚基（RAD21、SMC1、SMC3、SA1、SA2）和CTCF在整体染色质上的保留量。但ChIP-seq分析表明，RAD21在CTCF结合位点及黏连蛋白富集位点的信号普遍降低，而CTCF结合不受影响。H3K9Ac（组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化）信号增加，但其变化与RAD21信号降低无直接相关性。CTCF-CTCF环锚点处RAD21信号降低，但环强度维持，提示存在两种黏连蛋白群体。
**组蛋白过度乙酰化增加CTCF环对黏连蛋白环完整性的敏感性**
利用半体外核体系，在DMSO或TSA处理后的HAP1-RAD21
TEV细胞核中，在不同盐浓度下用TEV蛋白酶切割RAD21。Hi-C显示，TSA处理后的核中，RAD21切割导致CTCF-CTCF环信号丢失程度明显大于DMSO处理组（通过环线（loop-line）及差值分析）。无论环大小，TSA均增加了CTCF-CTCF环对RAD21切割的敏感性。而TAD内部环在TSA下已减少，进一步切割后所有环均消失。结果表明，组蛋白乙酰化虽不影响CTCF-CTCF环的拓扑结合模式，但降低了两条染色质纤维间的相互作用，使得环被切割后更易解离。
**CTCF位点处的两个黏连蛋白群体**
对不同尺寸CTCF-CTCF环的分析显示，TSA处理对各类环的强度影响均很小，但所有环对RAD21切割的敏感性均增加。RAD21 ChIP-seq信号在环锚点处降低程度类似，暗示在锚点处存在TSA敏感的黏连蛋白（非环绕、瞬时的）和TSA抵抗的黏连蛋白（拓扑环绕的）。研究提出黏连蛋白在CTCF位点停滞的两阶段模型：首先，TSA敏感的黏连蛋白以非环绕状态到达CTCF位点；随后，染色质完全进入环内，形成稳定的TSA抵抗性拓扑结构。
**讨论与结论**
讨论部分指出，TSA诱导的组蛋白过度乙酰化通过改变染色质表面电荷，削弱了TAD内部非拓扑性黏连蛋白的环挤压活性，而对CTCF位点拓扑性黏连蛋白维持的环影响甚微。CTCF位点处两种黏连蛋白群体的共存解释了ChIP-seq信号降低与环强度维持的矛盾。CTCF-CTCF环对RAD21切割敏感性增加，是由于乙酰化染色质纤维间相互作用减弱，一旦环打开，接触更易丢失。转录起始位点（TSSs）处黏连蛋白的拓扑结合可能在高乙酰化区域稳定转录机器，但其对切割的敏感性也提示开放染色质促进黏连蛋白去稳定。
**研究结论翻译**：总之，研究人员的发现支持一个模型，其中黏连蛋白至少以两种功能性和生化上不同的状态存在：一种动态的、TSA敏感的挤压形式，促进TAD内部接触；另一种稳定的、TSA抵抗的拓扑结合形式，锚定CTCF-CTCF环。组蛋白过度乙酰化选择性地破坏挤压群体，而保留CTCF-CTCF环锚定形式，揭示了染色质状态如何调节黏连蛋白的参与和活性。最后，有趣的是，虽然由挤压形式黏连蛋白介导的环对TSA敏感，但黏连蛋白的染色质结合并非如此。这表明黏连蛋白至少有两个与染色质的相互作用表面，两者都需要来维持染色质环的两个锚点，而其中只有一个表面的染色质结合是TSA敏感的。
