综述：基于细胞外基质工程的肝脏水凝胶作为先进仿生平台

《npj Gut and Liver》：Engineering extracellular matrix-based liver hydrogels as advanced bio-mimetic platforms

　　

人类肝脏在新陈代谢与免疫调节中执行关键功能。重现其细胞外基质（ECM）微环境是组织与疾病建模的核心。Matrigel?在组织培养与类器官形成中的主导地位，正日益受到脱细胞肝脏细胞外基质来源水凝胶的挑战；后者作为极具前景的替代物，保留了天然组织的固有复杂性，从而推进了肝类器官的形成与成熟以及高通量药物筛选。

引言

肝脏协调生命必需的众多生理过程，包括宏量营养素代谢、免疫支持及外源化合物分解。尽管对肝脏生理的理解已取得进展，构建复杂的仿生材料以复现精细的肝脏生物学仍具显著挑战。肝脏基质组（matrisome）涵盖广泛的细胞外基质（ECM）蛋白及相关因子，将ECM的认知从单纯结构支撑拓展至信号调节因子与生长因子的关键储库，赋能细胞双向通讯。健康肝脏中，基质组由胶原、糖蛋白与蛋白聚糖等平衡蛋白网络组成，支持细胞黏附、信号传导及组织稳态；基质组相关蛋白调控ECM重塑以维持动态组织维持。纤维化等疾病状态下，该平衡被破坏，纤维性肝脏表现为胶原VI与双糖链蛋白聚糖等结构性ECM蛋白过度沉积，引起粘弹性改变；ECM硬度增加触发机械转导通路，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，进一步硬化基质并形成正反馈环路。工程化微环境如具有可调机械性能的水凝胶，为解析机械转导通路提供见解。水凝胶定义为重量含水率超30%的三维交联聚合物材料，是重要的支架材料，可支持细胞生长、营养扩散与废物清除，密切模拟细胞微环境。其在体外有助于深入理解肝细胞行为、疾病建模及仿体内语境的药物测试；在体内则可作为细胞移植支架、促进肝脏再生并潜在作为临时肝脏替代物。基于脱细胞组织来源的ECM水凝胶是组织工程领域的显著进步。脱细胞化指在保留整体ECM结构及大部分基质组成分的前提下移除组织器官细胞组分，是开发组织工程生物活性材料的基础。ECM水凝胶试图保留原组织生化复杂性，这使其区别于单一ECM成分水凝胶，也区别于源自小鼠肉瘤细胞系的Matrigel^?。深入蛋白质组学表征揭示了健康与病变人类肝脏中庞大的基质组蛋白数目，强调在开发生物功能材料时需涵盖全部ECM蛋白集合。本综述意在厘清肝脏ECM水凝胶的这些层面，从生产到临床应用提供框架，指导类器官培养与再生医学个性化平台的发展。

从合成到表征：肝脏ECM水凝胶研究全景

在长期仿生材料创制中，水凝胶成为应对组织工程与再生医学挑战的途径。依起源与组成，水凝胶分合成、生物与杂化三类。合成水凝胶虽机械可预测且可修饰，但固有合成本质限制其模仿天然组织生化与生物物理特性。Matrigel^?作为当前三维组织与类器官培养金标准，因其肿瘤来源导致成分波动与安全疑虑，且缺乏天然对应物的多种ECM成分，机械性能异质，限制再生医学效用。天然替代物如胶原、明胶或纤维蛋白水凝胶生化定义明确且相容，但常无法代表天然基质组复杂生物构筑与生化组成。合成与杂化系统如聚乙二醇（PEG）水凝胶及自组装肽基质，虽增强空间生物化学控制，仍未能充分捕获天然基质组复杂性。为克服上述局限，脱细胞ECM（dECM）水凝胶因纳入广谱天然生物活性线索而前景广阔，被认可为从二维涂层到类器官培养乃至三维打印组织替代物的先进三维仿生平台。

脱细胞细胞外基质的加工与保存策略

ECM组分可通过化学、酶、物理或联合脱细胞技术获取。常规法依赖十二烷基硫酸钠（SDS）或Triton X-100等去污剂，或胰蛋白酶、DNA酶消化，虽能获天然架构与生化ECM支架，但可能破坏基质组超微结构并残留细胞毒物。非去污剂物理法如渗透休克、超声、冻融循环及超临界CO₂脱细胞，旨在最小化学改变下创建无免疫原性支架。限于组织可得性时，也可从体外肝细胞培养脱细胞获取基质组以模拟原生微环境。成功脱细胞后，冻干与粉碎利于保存ECM及后续操作，但可能改变胶原纤维形态与糖胺聚糖，影响再水合与细胞生长；冷冻干燥亦可调孔架构。灭菌必需，过氧乙酸、环氧乙烷、醇类、γ射线或超临界CO₂等方法可能减损糖胺聚糖、生长因子或胶原机械稳定性，故方法学透明对可重复研究至关重要。

水凝胶组装进展：方法学探究

肝脏基质组含大量难溶ECM蛋白，需酶解与机械法助溶。常用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或超声处理。成功溶解后，通过调整温度与pH可使功能蛋白自组装成水凝胶，并可用交联策略定制生物物理特征。

脱细胞ECM的溶解

胃蛋白酶消化是主流，于pH~2切解胶原等成均质预凝胶，中和至生理pH并缓冲后以37°C成胶；调节消化时间可控矩阵一致性。但其妥协原生架构，降解生长因子等高分子量活性物。木瓜蛋白酶于较温和pH起效，成本优但重现性待建；胰蛋白酶易致过度降解；胶原酶破坏纤维胶原不利成胶。超声处理利用机械能非特异崩解ECM，可增溶胶原I，缩短处理时长，拓宽浓度与粘弹性调控范围，且两法皆促巨噬细胞向修复表型转化。二者均需精准参数保全分子完整性。

单源与杂化：dLECM水凝胶两大策略

单源法纯用dLECM，保有其生物属性与低免疫原性，但调谐受限、批间变异存疑。杂化法耦联天然（藻酸盐、明胶、壳聚糖、胶原I、透明质酸）或合成聚合物（PEG、PEGDA、MAAh、pNIPAAM、PAA、PCL-MA、PLGA）或杂化分子（GelMA、CS-NHS、HA-NHS），可精细裁机械与降解性，却增复杂度与潜在免疫影响。依目标选材方能获适切细胞响应。

dLECM水凝胶的交联

交联剂含酪氨酸酶、戊二醛及光引发剂LAP或Irgacure 2959介导的光交联，后者具时空精度但须顾生物相容。光交联天然改性材料如GelMA渐兴；酶交联生物相容更优。理化联合交联可增强属性，但宜防过度交联掩蔽生物线索、阻细胞互作；体内应用尤需权衡整合与重塑。人及猪肝dECM水凝胶杨氏模量约315–322 Pa，低于Matrigel^?（~612 Pa）；浓度升则硬挺。酪氨酸酶交联储能模可达1928 Pa，甲基丙烯酰化压模5.1–39.9 kPa，映射健康至纤维化肝。软胶（~1 kPa）利肝细胞聚集上皮态，硬胶（~20 kPa）引间质表型；约1200 Pa结合透明质酸最适人肝细胞表型。天然肝硬度2–6 kPa，纤维化至硬化达10–20 kPa，故须准调力学以摹拟病理与再生。

水凝胶作为可打印生物墨水及粘弹性意义

生物墨水须剪切稀化以挤出打印。dLECM墨水机械偏弱，常混材增效。光交联甲基丙烯酰水凝胶以锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐（LAP）可达162 kPa，仿病态组织。储能模（G'）逾损耗模（G"）保形。挤出打印肝基质墨水温育HepG2活率85–93%；立体光刻辨达50 μm。纤维化肝刚度与粘弹性独立驱动癌演进，故须评多机械特征以筑精密疾病模型。

dECM水凝胶的体外与体内应用表征

表征含生化、生物物理与生物力学。电镜示微架构；孔隙率、溶胀与弥散关涉稳态。硬度与粘弹性导引细胞迁分；基质组年龄与种属影响蛋白谱。应评细胞毒与刺激响应智能水凝胶仿生动力。蛋白酶组学深析生长因子与细胞因子，明悉生物活性。

脱细胞肝脏ECM研究的挑战与机遇

脱细胞须平衡细胞清除与ECM架构保全，以避免疫激惹并促进建设性重塑。猪肝近人但基质组有异且硕大难处理；大鼠肝简省却缩放不足；绵羊山羊基材信息有限。人肿瘤肝如胆管癌组织可提供病生理线索，但可得性与异质性拘研展。机械搅动较灌流简易低价，适于切块脱细胞；SDS虽效佳却扰超微结构。冲洗不净致毒残，故协规优化与表征共识（H&E、DAPI、DNA量、电镜、胶原/弹性蛋白/糖胺聚糖定量及蛋白质组）乃保基质功能之本。

从细胞到生长组织：dLECM水凝胶再细胞化

HepG2与间充质基质细胞（MSC）常为再细胞模型。相较Matrigel^?，dLECM中肝细胞白蛋白、抗胰蛋白酶、尿素及CYP3A4更高；且抑星状细胞活化抗纤。原代肝细胞虽代谢真确却体外寿短难扩；MSC易得但传代衰老。多细胞共培如肝细胞与MSC类器官延功。三维密种与微流控精进微环境。转录析示ECM调基因，白蛋白泌泌在dECM较胶原控高数倍至十倍，CYP活性亦增。未来需标准化肝特异终点评测以导材料精调。

未来展望

肝脏组织工程汇生物学、材料学与工程之力。dLECM水凝胶偕类器官与打印、微流控将深化仿体微环境，智能释放与合成生物活材拓精准医疗。临床转译尚受批间差与免疫原残限，须标准流程。从材科学透视，唯深解单源或杂化各法，方筑共鸣天然ECM之再生支架。