《European Journal of Human Genetics》：Diagnostic discovery of structural variants causing foveal hypoplasia using SVRare and long-read nanopore sequencing
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DNA测序技术的进步正在提高遗传性孟德尔疾病患者及其家庭的分子诊断率。然而，一些患者在接受标准治疗检测（通常为外显子组或基因组测序）后仍未得到解决，结构变异（structural variants, SVs）可能占这些漏诊病例的很大比例。研究人员重新分析了10
DNA测序技术的进步正在提高遗传性孟德尔疾病患者及其家庭的分子诊断率。然而，一些患者在接受标准治疗检测（通常为外显子组或基因组测序）后仍未得到解决，结构变异（structural variants, SVs）可能占这些漏诊病例的很大比例。研究人员重新分析了10例之前通过全外显子组测序（whole exome sequencing, WES）未能解决的视觉障碍中心凹发育不良（foveal hypoplasia, FH）研究病例。研究人员使用了SVRare，这是一种整合Canvas和Manta输出，并结合等位基因频率及其基因组背景信息以突出可能致病性SVs的工具。该分析解决了10例中的2例。扩展这一策略后，研究人员随后在100,000基因组计划（100,000 Genomes Project, 100KGP）罕见病队列中采用反向遗传学方法，使用SVRare分析了一个FH相关基因panel。这又在另外11例先前未解决、表型与FH重叠的病例中鉴定出可能致病性SVs作为疾病原因。总共在13例患者中鉴定出5个基因的11个SVs很可能是FH的原因：SLC38A8（1例患者）、PAX6（3例）、OCA2（3例）、GPR143（5例）和CACNA1F（1例）。该分析还鉴定出多个携带一个看似新颖的OCA2缺失变异的携带者。然而，进一步分析表明，这实际上是30多年前首次发现的、在非洲人群中导致眼皮肤白化病（oculocutaneous albinism, OCA）的相对常见的创始人变异。这些发现表明，SVRare能有效识别有害SVs，并揭示了报告SVs的挑战，包括准确且一致地报告此类变异的重要性。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
遗传性孟德尔疾病的分子诊断率随着DNA测序技术的进步而显著提高，但仍有部分患者在接受标准检测（如外显子组或基因组测序）后未能获得明确诊断。结构变异（structural variants, SVs）——影响至少50个核苷酸的变异，包括缺失、插入、重复、倒位和易位——被认为是这些漏诊病例的重要原因。然而，由于短读长测序技术的固有局限，如重复序列导致读段比对模糊、高GC含量导致目标区域覆盖度降低等，SVs的检测难度较大，可能被低估。据估计，SVs约占未诊断遗传性视网膜疾病（inherited retinal disease, IRD）病例的11%。中心凹发育不良（foveal hypoplasia, FH）是一种以中心凹凹缺失为特征的视觉障碍，常与其他眼病（如白化病、无虹膜等）表型重叠，其遗传诊断面临挑战。此前，已有超过30个基因的致病性变异被证实可导致FH，但仍有大量病例的遗传病因尚未明确。为此，研究人员开展本研究，旨在评估SVRare工具在识别FH相关致病SVs中的效用，并结合长读长纳米孔测序技术，提高诊断率。该研究由牛津大学等机构合作完成，论文发表在《European Journal of Human Genetics》。
**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：对研究队列（10例本地招募的FH病例，经全外显子组测序未解决）进行短读长全基因组测序（whole genome sequencing, WGS），使用Canvas和Manta分别检测拷贝数变异（copy number variants, CNVs）和SVs，并由SVRare整合注释，结合内部队列等位基因频率和基因组背景（如编码序列破坏）进行优先级排序。对候选SVs，通过长距离PCR（long-range PCR）进行靶向富集，再使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION平台进行长读长纳米孔测序，以精确解析断点。此外，在100,000基因组计划（100,000 Genomes Project, 100KGP）罕见病队列（71,408名参与者）中，采用反向遗传学方法，利用SVRare筛选28个FH相关基因（包括白化病、无虹膜、先天性静止性夜盲等相关的基因）中的SVs，并通过IGV手动验证，排除假阳性。样本来源包括本地临床中心招募的FH患者及100KGP队列中的罕见病患者。
**研究结果**
**1. 鉴定出一个杂合性PAX6缺失**
对欧洲先证者P1（表现为孤立性FH，无家族史）的SVRare分析发现，11号染色体上存在一个24.2 kb的杂合缺失（NC_000011.10:g.31773553_31797722del），该缺失覆盖PAX6基因的外显子9-14（NM_001368894.2）和ELP4基因的外显子10（NM_019040.5），在gnomAD SV、dbVAR和DECIPHER数据库中均不存在。远端断点与LTR67B长末端重复元件相交。该SV根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics, ACMG）标准被分类为致病性。通过长距离PCR结合长读长纳米孔测序验证了缺失断点。PAX6变异常导致常染色体显性FH，但该缺失仅表现为孤立性FH，而非更严重的无虹膜表型，扩大了PAX6变异谱。
**2. 鉴定出一个半合子性GPR143缺失**
在一个南亚裔家庭中，先证者P2表现为视力差、眼球震颤和双眼黄斑穹顶状构型，符合眼白化病（ocular albinism, OA）表现。SVRare分析发现X染色体上存在一个597.3 kb的半合子缺失（NC_000023.11: g.9384920_9982211del），完全删除了TBL1X、GPR143、SHROOM2和CLDN34四个基因，被ACMG分类为致病性。该缺失在gnomAD SV、dbVAR和DECIPHER中均不存在。长读长纳米孔测序显示两个断点均与AluY短散在核元件（SINEs）相交，精确表征困难。GPR143致病性变异的半合子状态通常与X连锁OA相关，但先证者P2仅表现为FH和眼球震颤，可能反映了表型表达的年龄相关变异性。
**3. 在100KGP参与者中检测FH相关SVs**
对100KGP所有71,408名罕见病参与者，采用反向遗传学方法，通过SVRare筛选28个FH相关基因的SVs。共鉴定出2256个SVs，经等位基因计数和编码序列破坏过滤后，优先考虑了9个独特的SVs，涉及11名先前未获得分子诊断的参与者（表1）。这些SVs包括SLC38A8基因内倒位、PAX6缺失、OCA2缺失、GPR143缺失和CACNA1F缺失。通常每个SV仅出现在单个个体，但OCA2的一个插入缺失变异出现在参与者P4和P5中，GPR143的一个缺失出现在先证者P6及其外祖父P7中，并先证者母亲也被检出携带。所有变异位点的累积读段深度为31-78×，每位参与者的HPO术语提示视网膜缺陷与FH表型兼容。这些SVs很可能是各参与者疾病的原因，通过100KGP临床协作请求将基因组诊断告知了招募医生。
**4. 鉴定OCA2中一个频繁出现的SV**
在100KGP参与者中，一个OCA2的插入缺失变异（NC_000015.10: g.28017720_28020677delinsTTT）出现在两个非裔先证者P4和P5中。P4还携带另一个OCA2致病性错义变异（c.2228 C>T，p.(Pro743Leu)），P5携带另一个OCA2致病性变异（c.2323 G>C，p.(Gly775Arg)），但无法确定等位基因相位。此外，该OCA2 CNV在100KGP中另外28名参与者中被检出，这些参与者没有第二个致病性OCA2变异，且表型与FH无关。所有30个携带者中，18人为非洲或非裔加勒比裔（60%），6人为混合非洲或非裔加勒比裔（20%），至少80%具有非洲血统，而该人群仅占100KGP总人口的3.1%。这表明该变异可能是一个非洲裔创始人等位基因。单倍型分析显示，在三个非裔加勒比携带者中，一个44,808 bp区间（Chr15:27979889-28024696）内共享一个单倍型，包含该SV。第四名携带者的长读长纳米孔测序数据验证了该共享单倍型（24,699 bp）。该变异与30年前在南非OCA患者中报道的2.7 kb缺失（删除OCA2外显子7）高度一致，很可能是同一变异。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，本研究中SVRare结合长读长纳米孔测序显著提高了FH的诊断率，解决了2/10的研究病例和11例100KGP中未解决的病例。长读长测序克服了短读长测序在解析SV断点方面的局限，有助于更精确地报告变异。研究还发现了一个在非洲裔人群中富集的OCA2创始人插入缺失变异，这提示对非洲裔OCA患者进行诊断时，应优先靶向检测该变异，再考虑广泛筛查。此外，该发现凸显了SV报告中的不一致性问题，强调了准确和一致报告的重要性。
研究结论翻译如下：总之，研究人员使用SVRare（一种通过来自研究队列和/或其他SV数据库的等位基因频率数据、基因组背景、Canvas检测到的明显CNV区域以及Manta检测到的不一致配对和分裂读段比对来注释SV，以突出潜在致病性变异的分析包）分析了先前未解决的FH病例。该方法解决了2/10先前未解决的FH病例，并确定了来自100KGP的另外11个未解决病例中FH相关疾病的可能原因。此外，该分析鉴定出多个携带一个OCA2插入缺失变异的个体，该变异几乎可以肯定就是30年前在非洲OCA病例中发现的同一创始人变异。这一观察结果凸显了SV报告中的不一致性，并再次确认了需要长距离PCR和长读长测序来更准确地表征SV，以确保一致报告。这些结果表明，SVRare结合准确的临床诊断，能有效识别有害SVs，这是WES和WGS数据集诊断分析中的主要挑战之一。尽管财务和技术限制影响了最佳工作流程的设计，但显然WGS检测在检测结构变异（尤其是变异断点）方面能力更强。随着诊断中心开始采用长读长WGS作为一线检测，通过将SVRare或类似软件整合到分析流程中，并结合准确的临床表型分析，优化第三代测序仪的生物信息学流程，对于在未来几年实现检测灵敏度的提高至关重要。
