BubR1 TPR结构域通过促进MCC形成和MCC-APC/C相互作用支持有丝分裂检查点

《Communications Biology》：BubR1 TPR domain supports the mitotic checkpoint by promoting MCC formation and MCC-APC/C interaction

　　

BubR1是有丝分裂检查点的一个关键组分，该检查点是一种确保精确染色体分离的监控机制，通过促进有丝分裂检查点复合物（MCC）的组装并促进其与后期促进复合物/环体（APC/C）的结合。尽管BubR1在有丝分裂检查点中的作用已被广泛研究，但其N端四肽重复（TPR）结构域的功能仍知之甚少。在本研究中，研究人员首先确立了BubR1 TPR结构域在有丝分裂检查点中的关键作用。在已解析的MCC-APC/C复合物冷冻电镜（cryo-EM）结构指导下，研究人员鉴定并表征了BubR1 TPR结构域与Mad2、Cdc20^APC/C和Apc2之间的几种相互作用。此外，研究人员发现了TPR结构域与BubR1下游残基之间的分子内相互作用，该相互作用似乎组织了一个类似于“套索”的结构，该结构整合了四个Cdc20^APC/C结合元件，从而增强与APC/C中Cdc20的结合。功能与生化分析表明，这些相互作用共同促进MCC组装和MCC-APC/C结合，使得在微管-动粒附着缺陷时能够快速激活纺锤体组装检查点（SAC）。

有丝分裂检查点（也称纺锤体组装检查点，SAC）是确保细胞分裂中染色体准确分离的关键监控机制，其核心在于形成有丝分裂检查点复合物（MCC）以抑制后期促进复合物/环体（APC/C）。BubR1是MCC和SAC信号的关键组分，但其N端四肽重复（TPR）结构域的功能长期未明。尽管已知BubR1通过多个短线性相互作用基序（SLiM）参与检查点，但TPR结构域是否直接参与SAC、其与Mad2、Cdc20^APC/C及Apc2的相互作用机制，以及是否存在分子内调控，均不清楚。近年MCC-APC/C复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构（PDB: 6TLJ）提供了高分辨率结构，为解析这些未解问题奠定了基础。该研究发表于《Communications Biology》。

研究人员利用HeLa细胞（来源于ATCC），通过以下关键技术方法开展研究：基于cryo-EM结构分析指导的定点突变；RNA干扰（RNAi）结合抗性拯救实验，以活细胞成像测量有丝分裂阻滞时间评估SAC活性；免疫沉淀（IP）检测MCC组装和MCC-APC/C结合能力；体外GST pull-down实验验证直接蛋白相互作用；序列比对分析保守性。

**研究结果：**

**The BubR1 TPR domain plays a critical role in SAC signaling**
通过构建缺失TPR结构域（BubR1ΔTPR）或替换为Bub1 TPR结构域（BubR1 B1TPR）的突变体，进行RNAi拯救实验和活细胞成像。结果发现，两种突变体虽能正确定位到动粒，但均不能恢复SAC功能，导致有丝分裂阻滞时间显著缩短（中位时间约20分钟 vs 野生型660分钟）。免疫沉淀显示BubR1 B1TPR突变体无法形成MCC，表明TPR结构域对MCC组装至关重要。

**The BubR1-Mad2 interaction is essential for SAC signaling**
结构分析揭示BubR1 TPR结构域延伸的HLH基序中W22和E23与Mad2的F141和R133临近。突变W22A/E23A或E23A后，活细胞成像显示SAC完全失效（中位阻滞时间约20分钟），且免疫沉淀证实MCC形成受损。体外GST pull-down实验表明，BubR1 TPR（1-220）与Mad2 L13A（关闭构象）的直接结合因W22A/E23A突变而显著减弱，证实了该直接相互作用对SAC的必要性。

**The BubR1 TPR-Apc2 interaction is important for SAC signaling**
结构分析显示BubR1 TPR的R169、F175、V200、L205与APC/C组分Apc2相互作用。四联突变（RFVL/4A）完全破坏SAC，但免疫沉淀发现该突变同时抑制MCC组装和APC/C结合。精细化突变R169A/F175A主要破坏MCC形成，而V200A/L205A主要破坏APC/C结合，且两者均显著削弱SAC（中位阻滞时间分别约70分钟和185分钟 vs 野生型515分钟），表明TPR-Apc2相互作用促进MCC-APC/C结合。

**The BubR1 TPR-Cdc20^APC/C interaction is critical for SAC signaling**
结构分析发现BubR1 TPR的E134、D137与Cdc20^APC/C的R286形成静电相互作用。突变E134R、D137R或Cdc20 R286E均几乎完全消除SAC活性（中位阻滞时间约20分钟）。免疫沉淀显示D137R突变体维持MCC形成但失去APC/C结合；E134R部分影响MCC。此外，TPR中疏水残基（W125、L128、C132、M138）形成的疏水口袋增强该静电相互作用，四联突变（WLCM/4A）同样严重削弱SAC并破坏APC/C结合，不影响MCC。单点突变C132E也导致APC/C结合近乎完全丧失，证实了该相互作用的关键性。

**The BubR1 TPR domain binds downstream residues to form a lasso-like structure for capturing Cdc20^APC/C**
结构分析揭示BubR1 TPR的Y141、E103与下游W295、R302（位于KEN2基序附近）形成分子内相互作用，组织成一个套索状结构，该结构整合了四个Cdc20^APC/C结合元件（D1、ABBA1、KEN2、E134/D137静电界面）。突变Y141A、W295A、E103R、R302E不同程度削弱SAC，双突变体（E103R/Y141A或W295A/R302E）几乎完全失效。免疫沉淀显示Y141A或W295A单突变体维持MCC形成但严重丧失APC/C结合。序列比对显示这些残基从人类到酵母高度保守（果蝇例外），支持该结构的功能重要性。

**总结讨论**
研究结论部分总结：BubR1 TPR结构域通过一个相互作用网络在有丝分裂检查点中发挥关键作用，该网络包括与Mad2、Cdc20^APC/C、Apc2的直接结合以及分子内套索结构与下游残基的相互作用。这些相互作用协同增强MCC组装、稳定MCC-APC/C结合，并有效阻断Cdc20^APC/C与底物接触，从而在微管-动粒附着缺陷时实现快速SAC激活。特别地，套索结构通过空间协调多个结合位点（包括传统KEN框、D框、ABBA基序及新发现的静电界面）提高捕获Cdc20^APC/C的效率。讨论指出，BubR1-Mad2相互作用可能依赖于Cdc20介导的邻近效应，且套索结构可能在MCC组装过程中形成，其破坏导致APC/C结合缺陷而非直接丧失Cdc20结合，可能因慢速结合导致活性APC/C介导的Cdc20泛素化释放。该研究为理解BubR1 TPR结构域在SAC中的分子机制提供了系统性见解。