基于深度学习的虚拟筛选识别ASK1潜在小分子抑制剂：MASH的天然产物先导发现

《International Journal of Molecular Sciences》：Deep Learning-Based Virtual Screening Identifies Potential Small-Molecule Inhibitors of ASK1: Natural Product Lead Discovery for MASH

　　

凋亡信号调节激酶1（ASK1）是代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的关键治疗靶点。天然产物因其独特的化学多样性，成为发现新型ASK1抑制剂的丰富资源。人工智能辅助药物发现（AIDD）的出现为探索小分子抑制剂开辟了新途径。通过虚拟筛选、分子对接、相互作用分析、分子动力学模拟和MM-GBSA结合自由能计算，研究人员系统评估了CMNPD10921–ASK1复合物的结合模式、稳定性和关键残基贡献。CMNPD10921稳定占据ASK1活性口袋，与多个关键氨基酸残基形成疏水相互作用和氢键。MM-GBSA分析得到总计算结合自由能为?31.15 kcal/mol，表明计算上有利的相互作用，其中范德华力是复合物稳定的主要能量驱动因素。残基能量分解进一步确定ILE324、THR288和THR639是配体结合的主要贡献者。本研究整合深度学习、分子模拟和量子化学计算，成功从庞大的天然产物库中识别出CMNPD10921作为靶向ASK1中心调控区的潜在先导化合物候选物，为抗MASH药物开发提供了新型候选分子。

**研究背景与问题**
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是世界上最常见的慢性肝病谱系之一，随着代谢紊乱、肥胖和2型糖尿病患病率上升，疾病负担迅速扩大。国际共识已将传统NAFLD/NASH命名更新为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），以更好反映代谢发病机制。MASH不仅以肝脂肪变性、气球样变和小叶炎症为特征，更关键的是肝纤维化进展。纤维化阶段与肝脏相关事件、肝移植需求和全因死亡率密切相关。因此，阻断肝细胞应激损伤、炎症放大和纤维化沉积是MASH治疗策略的核心。当前MASH药物开发进展迅速，但MASH具有高度异质性，单一代谢干预可能无法充分覆盖炎症、细胞死亡和纤维化进展的病理维度。凋亡信号调节激酶1（ASK1）是一种应激反应性丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K），可被氧化应激、脂毒性、内质网应激、炎症细胞因子和线粒体功能障碍等多种病理刺激激活。激活后，ASK1磷酸化MKK4/7和MKK3/6，启动JNK和p38 MAPK信号通路，调控凋亡、炎症细胞因子表达、肝星状细胞活化和细胞外基质沉积。由于氧化应激和脂毒性损伤贯穿MASH发病的多个阶段，ASK1被视为连接代谢应激与纤维化进展的关键枢纽。抑制ASK1在MASH动物模型中可改善炎症和纤维化，且ASK1敲除小鼠在基础条件下无显著表型，支持ASK1抑制作为潜在安全治疗策略。尽管已有多种小分子ASK1抑制剂（如selonsertib、NQDI-1、K811）在临床前和临床中评估，但尚无获批药物。天然产物因其结构新颖性和生物活性多样性，海洋天然产物尤其具有独特骨架，是发现新抑制剂的丰富资源。计算机辅助药物设计和人工智能辅助药物发现（AIDD）显著改变了早期药物开发流程。在此背景下，研究人员整合深度学习、分子模拟和量子化学计算，系统筛选评估ASK1潜在小分子抑制剂。

**研究内容与结论**
本研究通过整合基于深度学习的口袋预测、天然产物类药性过滤、DiffDock高通量虚拟筛选、QVina2分子对接交叉验证、PLIP相互作用分析、分子动力学模拟、MM-GBSA结合自由能计算和DFT电子结构分析，从COCONUT和CMNPD两个天然产物数据库中系统筛选并评估ASK1潜在抑制剂。经过多层级筛选，最终从CMNPD数据库识别出CMNPD10921作为候选先导化合物。该化合物稳定占据ASK1预测结合口袋，与THR288、THR639、LYS505、LEU511和ARG284形成多点相互作用；200 ns分子动力学模拟支持复合物的构象稳定性；MM-GBSA计算总结合自由能为?31.15 kcal/mol，范德华力为主要有利贡献；DFT分析表明该分子具有良好电子响应性和适度极化适应性。该研究为抗MASH药物开发提供了新的天然产物先导线索。

**论文发表期刊**
《International Journal of Molecular Sciences》

**主要关键技术方法**
研究人员利用以下关键技术方法：（1）**深度学习口袋预测**：使用基于图神经网络的UniSite模型识别ASK1蛋白表面潜在配体结合位点，选取药物评分≥0.8且体积最大的口袋作为靶点。（2）**虚拟数据库构建与类药性过滤**：从COCONUT数据库（约695,000个化合物）和CMNPD海洋天然产物子集中，依据Lipinski五规则（RO5）和定量类药性评分（QED）过滤，分别获得37,280和47,450个化合物，并使用RDKit生成三维结构。（3）**AI辅助虚拟筛选**：使用DiffDock（1.1.3版）进行深度学习蛋白-配体结合评估，根据置信度分数筛选，最终以置信度>20为阈值选取候选化合物。（4）**传统分子对接与相互作用分析**：使用QVina2进行交叉验证，评估结合能（BE）；利用PLIP工具分析非共价相互作用类型。（5）**分子动力学模拟**：使用GROMACS（2024.4版）进行200 ns模拟，评估复合物稳定性。（6）**结合自由能计算**：采用MM-GBSA框架计算结合自由能并进行残基能量分解。（7）**DFT电子结构分析**：使用ORCA 5.0.4在B3LYP/def2-TZVP水平计算前线分子轨道能级和HOMO-LUMO能隙。

**研究结果**
**2.1 结合口袋识别**
UniSite模型在ASK1上识别出11个潜在结合口袋，研究人员选取药物评分≥0.8且体积最大的口袋作为后续虚拟筛选靶点。该口袋位于ASK1中心调控区的深部结构域间裂隙，符合典型小分子结合腔特征。

**2.2 虚拟数据库构建**
对初始天然产物配体库进行类药性评估，经Lipinski五规则和QED分数过滤，从COCONUT数据库获得37,280个化合物，从CMNPD获得47,450个化合物，共84,730个化合物，随后生成三维结构并转换为PDBQT格式。

**2.3 AI辅助药物筛选**
使用DiffDock对84,730个配体进行深度学习蛋白-配体结合评估。从COCONUT中选出6505个候选化合物（其中48个置信度>0），从CMNPD中选出6338个候选化合物（其中33个置信度>0）。进一步以置信度>20为阈值精选，得到表1所列候选化合物。

**2.4 分子对接**
使用QVina2对精选化合物进行分子对接并计算结合能。CMNPD10921与ASK1的结合能最负，表现出优秀的预测结合亲和力，被指定为核心候选化合物。

**2.5 相互作用模式分析**
PLIP分析显示，CMNPD10921与ASK1的五个关键残基（THR288、THR639、LYS505、LEU511、ARG284）形成5个疏水相互作用和3个氢键，表明两者可形成相对稳定的对接复合物。

**2.6 分子动力学模拟**
200 ns分子动力学模拟显示，ASK1–CMNPD10921复合物的蛋白骨架RMSD和配体RMSD在模拟后期均表现强稳定性，均方根波动（RMSF）分析表明残基和小分子波动极小，回转半径（Rg）变化极小，表明蛋白保持紧凑折叠状态。二维吉布斯自由能景观（FEL）分析揭示单一或相邻的低能盆地，氢键分析显示100 ns后氢键数量稳定。

**2.7 结合自由能计算**
MM-GBSA计算得到总结合自由能为?31.15 kcal/mol，其中范德华相互作用（ΔVDWAALS）为?40.59 kcal/mol，是主要贡献者；静电相互作用（ΔEEL）在气相中有利（?8.41 kcal/mol），但被极性去溶剂化惩罚（ΔEGB = +23.87 kcal/mol）部分抵消；非极性溶剂化（ΔESURF = ?6.03 kcal/mol）贡献适度有利。残基能量分解表明，ILE324贡献最大，ALA508、GLN325、GLU619、GLU640、GLY289、THR288和THR639贡献有利，而ALA549、ARG284、ASP323、CYS638、LEU511、LYS505、PRO507和THR506贡献不利。

**2.8 DFT电子结构评估**
DFT计算得到CMNPD10921的HOMO能量为?5.630530 eV，LUMO能量为?4.630266 eV，HOMO-LUMO能隙为1.000264 eV。该中等偏低能隙表明分子具有良好电子响应性和适度极化性，有利于与靶蛋白结合时的电子重排，增强相互作用稳定性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究建立了以应激信号靶点ASK1为中心的多层级筛选流程，结果支持CMNPD10921作为ASK1潜在小分子抑制剂。CMNPD10921的化学名为10-羟基-18-N-2-萘基-N-苯氨基β-烯酮，分子式C₃₇H₄₅NO₅，相对分子质量约583.77 g/mol，具有大疏水碳骨架。其稳定结合源于疏水接触、芳香环相互作用、范德华力和局部极性相互作用的组合。研究人员强调，ASK1功能可能具有细胞类型依赖性、损伤模式依赖性和疾病阶段依赖性，后续研究应区分肝细胞、肝星状细胞、库普弗细胞和巨噬细胞中的效应。本研究使用ASK1中心调控区结构（PDB: 5ULM）而非激酶催化域，旨在探索变构调节机制。MM-GBSA与PLIP分析之间的差异在方法学上是合理的，因为PLIP基于静态几何标准，而MM-GBSA对轨迹快照进行能量平均。分子动力学模拟支持复合物稳定性，DFT分析提示氧化代谢风险。本研究未与已知ASK1抑制剂（如selonsertib、NQDI-1）进行直接计算比较，因为主要目标是探索结构新颖的天然产物支架。所有发现均基于计算预测，需通过实验验证。

**结论**（翻译原文结论部分）
本研究采用系统性计算方法，整合基于深度学习的虚拟筛选、分子对接、相互作用分析、分子动力学模拟、MM-GBSA结合自由能计算和DFT电子结构分析，将CMNPD10921识别为ASK1中心调控区的假定配体。汇聚的计算证据——包括200 ns MD模拟中稳定的复合物形成、以范德华相互作用为主的?31.15 kcal/mol有利MM-GBSA结合自由能，以及关键相互作用残基ILE324、THR288和THR639——支持该海洋来源天然产物作为进一步研究的候选物。但必须强调，本研究仅表明CMNPD10921可稳定占据所选调控区口袋，未提供直接证据证明其对ASK1激酶活性的变构调节，所有发现仍处于计算预测阶段。未来的实验验证——通过生物物理结合测定、酶活性测量、细胞功能研究和药代动力学分析——对于确立CMNPD10921在抗MASH药物开发中真正的生物学相关性和治疗潜力至关重要。