《International Journal of Molecular Sciences》：Impact of Deoxynivalenol, Cytokines, and Particulate Matter on Human Trophoblast Cells
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胎盘炎症与功能障碍在不良妊娠结局（包括子痫前期与宫内生长受限）中发挥关键作用。暴露于环境因素（如饮食毒素、感染因子与污染）被认为会增加此类结局的风险。尽管HTR-8/SVneo与BeWo细胞作为滋养层模型被广泛应用，但它们对同一实验框架内母体暴露组（mater
胎盘炎症与功能障碍在不良妊娠结局（包括子痫前期与宫内生长受限）中发挥关键作用。暴露于环境因素（如饮食毒素、感染因子与污染）被认为会增加此类结局的风险。尽管HTR-8/SVneo与BeWo细胞作为滋养层模型被广泛应用，但它们对同一实验框架内母体暴露组（maternal exposome）相关刺激的比较敏感性尚未被系统评估。研究人员检测了HTR-8/SVneo与BeWo滋养层细胞系对真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）、炎性细胞因子鸡尾酒（Cytokine Cocktail, CC；TNF-α、IL-1β、IFN-γ）与颗粒物（Particulate Matter, PM2.5）的反应。细胞在含0.2%或1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin, P/S）条件下接种并暴露24小时。分析了细胞因子分泌（IL-6与IL-8）、人绒毛膜促性腺激素（human Chorionic Gonadotropin, hCG）产生，以及连接标志物（ZO-1、OCLD、CLDN-3、CLDN-4、E-CAD）的mRNA与蛋白表达。DON显著增加了两株细胞系的IL-6分泌，并仅在HTR-8/SVneo细胞中升高了IL-8水平。DON抑制了两株细胞系的hCG产生。CC暴露显著升高了IL-6与IL-8水平（尤其在HTR-8/SVneo细胞中），但不影响hCG水平。PM暴露未显著改变任一细胞系的IL-6、IL-8或hCG水平。DON与CC改变了BeWo细胞中连接标志物的mRNA与蛋白表达（ZO-1、OCLD、CLDN-3、CLDN-4），而HTR-8/SVneo细胞显示变化更有限。大多数细胞反应在两种P/S浓度下保持一致。HTR-8/SVneo与BeWo细胞对DON、CC与PM2.5表现出差异性敏感，强调了体外胎盘毒理学研究中细胞模型选择的重要性。这些结果为解释滋养层对母体暴露组相关刺激的反应提供了比较框架，并强调了未来研究中功能验证的必要性。
该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。研究背景方面，人类胎盘作为母胎循环之间的界面，由多种细胞类型组成，包括细胞滋养层（Cytotrophoblasts, CTBs）、合体滋养层（Syncytiotrophoblasts, SCTs）与extravillous trophoblasts（EVTs）。CTBs分化为SCTs与EVTs，在营养与气体交换、激素产生及子宫动脉重塑中起关键作用。这些过程可被来自母体环境的外部刺激破坏，从而损害胎盘功能。尽管HTR-8/SVneo与BeWo细胞系在胎盘研究中被广泛使用，但尚无研究在同一实验框架内直接系统比较它们对母体暴露组相关刺激的敏感性，这一空白限制了研究间变异性的解释与合理模型选择。此外，初步观察提示标准抗生素浓度可能降低细胞对某些刺激的响应，因此研究人员将0.2%与1%青霉素/链霉素（P/S）作为方法学验证步骤纳入。研究人员选取三类刺激代表母体暴露组潜在有害组分：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON，镰刀菌产生的霉菌毒素，常见于污染谷物，可跨胎盘屏障）、炎性细胞因子鸡尾酒（Cytokine Cocktail, CC；TNF-α、IL-1β、IFN-γ，代表母体重症免疫激活）与颗粒物（Particulate Matter, PM2.5，环境污染物，可进入血液循环并在胎盘累积）。研究人员系统比较两株细胞对上述刺激在炎性细胞因子产生、屏障完整性与激素分泌方面的反应，以阐明环境暴露如何损害胎盘功能与胎儿发育。研究表明两株细胞对DON、CC与PM2.5存在差异性敏感，DON与CC可改变连接标志物表达且具有细胞系依赖性，PM2.5在24小时暴露下未引起显著变化，大多数反应在两种P/S浓度下一致，强调胎盘毒理学研究中细胞模型选择的重要性，并为后续机制与功能验证提供依据。
为开展研究，研究人员使用的主要关键技术方法包括：以人胎盘绒毛膜癌细胞系BeWo（ATCC-CCL-98）与人extravillous trophoblast样细胞系HTR-8/SVneo（ATCC-CRL-3271）为体外模型，分别在含0.2%或1% P/S的培养基中培养至80%汇合后，给予4 μM DON、CC（各细胞因子10 ng/mL）或10 μg/mL PM2.5（NIST2786）暴露24小时。通过乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放法评估细胞毒性；采用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测上清中IL-6、IL-?8与hCG浓度；利用定量聚合酶链反应（quantitative PCR, qPCR）分析连接标志物（ZO-1、OCLD、CLDN-3、CLDN-4、E-CAD）的mRNA表达（以β-actin为内参，2?ΔΔCt法计算）；通过蛋白质印迹（Western blot）分析上述连接标志物的蛋白表达（以β-actin为上样对照，密度定量）；数据统计采用双因素方差分析（two-way ANOVA）与Dunnett检验，p<0.05为显著差异。
研究结果如下，保留小标题并说明研究与结论：
2.1. Exposure to DON, CC and PM Did Not Lead to Cytotoxicity in HTR-8/SVneo and BeWo Cells
通过LDH释放检测评估细胞毒性，结果显示对照组与暴露组（DON、CC、PM）的LDH释放均低于15%，所用浓度在非毒性范围。BeWo细胞在1% P/S下的LDH释放显著高于0.2% P/S，但未超过15%毒性阈值，仍视为非毒性。结论为在本实验浓度与24小时暴露下，DON、CC与PM对两株细胞均无显著细胞毒性。
2.2. HTR-8/SVneo and BeWo Cells Released IL-6 upon Exposure to DON and CC, but Only HTR-8/SVneo Cells Are Capable of IL-8 Production
通过ELISA检测上清细胞因子。HTR-8/SVneo细胞中，CC在两种P/S浓度下均显著增加IL-6分泌，DON与PM无影响；HTR-8/SVneo细胞中仅CC显著增加IL-8分泌，DON与PM无影响。BeWo细胞中，DON与CC在两种P/S下均显著增加IL-6分泌，PM无影响；BeWo细胞上清未检测到IL-8。结论为DON与CC诱导两株细胞IL-6分泌但存在细胞系差异，仅HTR-8/SVneo可产生IL-8，PM对两株细胞IL-6与IL-8均无显著影响。
2.3. Differential Effects of DON and CC on hCG Hormone Production in HTR-8/SV Neo Cells and BeWO Cells
通过ELISA检测hCG。HTR-8/SVneo细胞中，DON在两种P/S下均降低hCG；CC仅在0.2% P/S下降低hCG，1% P/S下无影响；PM无影响。BeWo细胞中，仅DON在两种P/S下显著降低hCG，CC与PM均无影响。对照组BeWo的hCG低于HTR-8/SVneo。结论为DON抑制两株细胞hCG产生且具有浓度一致性，CC对hCG的影响具有细胞系与P/S依赖性，PM不影响hCG。
2.4. Alterations in mRNA Expression of Junctional Proteins in HTR-8/SVneo and BeWo Cells After Exposure to DON, CC or PM
通过qPCR检测连接标志物mRNA。HTR-8/SVneo中未检测到CLDN4与E-CAD；DON显著增加ZO-1与OCLD mRNA（OCLD依赖1% P/S），CLDN-3无影响；CC与PM无显著改变。BeWo中，DON显著增加OCLD与CLDN-3 mRNA（CLDN-3依赖0.2% P/S），降低E-CAD，ZO-1与CLDN-4无变化；CC仅在0.2% P/S下增加E-CAD mRNA；PM无显著影响。结论为DON与CC可改变两株细胞连接标志物mRNA表达且具有细胞系、标志物与P/S依赖性，PM在mRNA水平无显著影响，HTR-8/SVneo缺乏部分上皮标志物表达。
2.5. Effects of DON, CC and PM on Protein Expression of Junctional Proteins
通过Western blot检测蛋白表达，HTR-8/SVneo同样未检出E-CAD与CLDN4蛋白。DON暴露下，HTR-8/SVneo的ZO-1、OCLD、CLDN3蛋白无显著变化；BeWo中ZO-1、OCLD蛋白在两种P/S下均显著上调，CLDN3与CLDN4在0.2% P/S下上调，E-CAD蛋白无显著变化。CC暴露下，HTR-8/SVneo三者均无变化；BeWo中CLDN3与CLDN4蛋白在1% P/S下下调，ZO-1、OCLD、E-CAD无变化，E-CAD mRNA上升未转化为蛋白变化。PM暴露下两株细胞所有检测蛋白均无显著变化。结论为DON与CC对连接蛋白的影响在mRNA与蛋白水平存在部分不一致，具转录及翻译后调控特征，且细胞系差异明显，PM在蛋白水平亦无显著影响。
讨论部分总结：研究人员讨论指出，母体环境因素可破坏胎盘结构功能并影响胎儿长期健康。DON广泛存在于食品，孕妇暴露可能超标并可跨胎盘，本研究发现DON诱导两株细胞IL-6升高及HTR-8/SVneo的IL-8升高，抑制hCG，改变BeWo连接标志物表达，而HTR-8/SVneo反应有限，可能与混合上皮间充质特性有关。CC暴露下HTR-8/SVneo的IL-6与IL-8增幅远高于BeWo，提示EVT样细胞对炎症更敏感；BeWo中CLDN3与CLDN4蛋白下调提示紧密连接易受炎症影响，HTR-8/SVneo无变化可能与其侵袭迁移功能相关。PM未在24小时暴露下引起显著炎性、激素或连接蛋白改变，与部分文献差异可能源于暴露时间（48小时 vs 24小时）与浓度不同，提示更长暴露可能必要。大多数反应在0.2%与1% P/S间一致，说明抗生素浓度在测试范围内不影响主要结论。讨论强调连接标志物变化仅为屏障功能间接指标，需跨上皮电阻（Trans-Epithelial Electrical Resistance, TEER）或通透性实验等功能验证。
研究结论部分翻译：该研究揭示了脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、炎性细胞因子鸡尾酒（CC）与颗粒物（PM）对BeWo与HTR-8/SVneo胎盘细胞系在细胞因子分泌、人绒毛膜促性腺激素（hCG）产生及连接标志物mRNA与蛋白表达上的差异性影响。据研究人员所知，本文首次报道DON显著增加HTR-8/SVneo细胞中IL-6与IL-8分泌。虽然DON抑制两株细胞hCG产生，但CC不影响hCG水平，突出了炎症条件下hCG产生的韧性。研究还发现PM暴露未显著影响两株细胞的IL-6、IL-8或hCG水平。在分子水平上，DON与CC以细胞系依赖方式改变连接标志物表达，提示滋养层连接组织可能发生潜在改变；然而需要功能实验（如TEER或通透性测量）来直接确认对屏障完整性的影响。大多数细胞反应在两种P/S浓度（0.2%与1%）下保持一致，表明所观察的反应在测试范围内对抗生素浓度具有稳健性，且所观察效应归因于刺激本身而非滋养层细胞培养中所用抗生素浓度。总之，这些结果表明HTR-8/SVneo与BeWo细胞对暴露组相关刺激表现出差异性敏感，强调了体外胎盘毒理学研究中细胞模型选择的重要性。鉴于孕期对此类环境因素的暴露往往不可避免，这些发现值得进一步研究其潜在机制及对胎盘功能与胎儿健康的意义。
