《International Journal of Molecular Sciences》：Comparative Analysis of Viral Communities in Hospital, University and Urban Wastewater by Shotgun Metagenomic Sequencing
编辑推荐：
废水基监测（Wastewater-based surveillance, WBS）已成为一种以及时且非侵入性方式进行人群水平病原体循环监测的有力手段。在本研究中，研究人员应用鸟枪法宏基因组测序（Shotgun Metagenomic Sequencing, M
废水基监测（Wastewater-based surveillance, WBS）已成为一种以及时且非侵入性方式进行人群水平病原体循环监测的有力手段。在本研究中，研究人员应用鸟枪法宏基因组测序（Shotgun Metagenomic Sequencing, MSS）对采集自医院（HP）、大学校园（UN）和城市污水处理厂（WTP）的废水样本进行分析，并使用Kraken2对病毒序列进行 taxonomic 分类。具体而言，HP样本显示出最高的病毒丰富度，其次为WTP和UN样本（HP vs. UN, p = 0.0003；WTP vs. UN, p = 0.0018）。利用Jaccard距离观察到WTP与UN（R2 = 0.181, p < 0.001）、WTP与HP（R2 = 0.159, p < 0.001）以及UN与HP（R2 = 0.223, p < 0.001）之间存在显著差异；同样地，对于S?rensen–Dice相异性指数：WTP vs. UN（R2 = 0.238, p < 0.001）、WTP vs. HP（R2 = 0.212, p < 0.001）以及UN vs. HP（R2 = 0.307, p < 0.001）亦如此。在所有采样来源中均检测到与人相关的病毒科，主要为痘病毒科（Poxviridae）、单纯疱疹病毒科（Orthoherpesviridae）、多瘤病毒科（Polyomaviridae）和圆环病毒科（Circoviridae）。此外，研究人员还检测了主要包含安奈洛病毒科（Anelloviridae）和Crassvirales在内的间接相关病毒的分类组成。总体而言，这些发现支持了废水宏基因组学作为环境与公共卫生背景下监测病毒多样性的可靠工具的潜力，尽管仍需进一步研究以确立其在One Health框架内常规监测运行中的实用性。
该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。研究背景方面，废水基流行病学（Wastewater-based epidemiology, WBE）在过去数十年中已发展为一种多学科监测范式，可用于监测传染病、抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）、药物残留及环境污染物。COVID-19大流行进一步凸显了WBE作为新发传染病早期预警系统的相关性，而鸟枪法宏基因组测序（MSS）的引入则将该领域从靶向检测转变为全面、非靶向且无需假设的方法。然而，目前大多数监测项目仍聚焦于特定病原体的靶向识别（如SARS-CoV-2），针对医院、大学校园与城市污水处理厂等不同人群来源废水中广泛病毒群落的未靶向宏基因组特征刻画研究相对匮乏，且比较数据集有限，阻碍了对人口统计学、行为与健康因素如何影响废水病毒组的理解。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过比较高异质性人群来源的废水病毒组，评估宏基因组废水分析作为公共卫生监测系统常规组成部分的潜力，并确定可能与人群背景相关的病毒特征。
为开展研究，研究人员于2025年2月至7月在意大利佩鲁贾（Perugia）的三个不同位点（医院HP、大学校园UN、污水处理厂WTP，相互最大距离6 km且WTP不接收医院污水）每月采集废水样本，每位点每次由3个1 L抓取子样本混合成1个复合样本，共获得18个原始样本；每个原始样本分别采用序列无关单引物扩增（Sequence-Independent Single-Primer Amplification, SISPA，用于RNA病毒）和多位点置换扩增（Multiple Displacement Amplification, MDA，用于DNA病毒）两种方法进行文库制备与测序，最终获得36个数据集；随后使用Fastp进行质量过滤，通过Kraken2（配合Standard PlusPFP数据库）进行病毒序列分类，并利用Bracken重新估计分类群丰度，提取病毒读取后结合ViralZone人相关病毒列表进行筛选，最后在R Studio中采用Kruskal–Wallis检验、PERMANOVA（基于Jaccard距离与S?rensen–Dice相异性）等进行统计分析。
研究结果如下。2.1. 各采样点分类学丰富度（Taxonomic Richness Across Sampling Sites）：研究人员在科、属、种三个分类等级上统计各样本检测到的分类群数量，发现HP和WTP样本在所有等级上均表现出较高的分类学丰富度，而UN样本检测到的分类群数量持续较低，表明UN样本的病毒群落复杂性降低，组间差异具有显著性（p < 0.001）。2.2. 多样性分析（Diversity Analysis）：Alpha多样性分析显示观测物种丰富度存在显著位点差异（p = 0.0001），HP最高（均值287），其次为WTP（252）和UN（97），HP与WTP显著高于UN（HP vs. UN, p = 0.0003；WTP vs. UN, p = 0.0018）。Beta多样性分析（Jaccard距离与S?rensen–Dice相异性）通过PCoA和PERMANOVA表明位点解释了显著的变异比例（Jaccard R2 = 0.235；S?rensen–Dice R2 = 0.311，均p < 0.001），所有成对比较均显著，其中UN与HP差异最大，S?rensen–Dice判别力更强；双因素PERMANOVA证实位点而非扩增方法是群落结构的主要驱动因子。2.3. 人相关病毒的宏基因组检测与丰度（Metagenomic Detection and Abundance of Human-Related Viruses）：研究人员筛选出人健康相关病毒科/属进行分析，发现Poxviridae、Orthoherpesviridae和Polyomaviridae（双链DNA病毒，dsDNA）在各样本类型中丰度较高，主要通过MDA检测；Circoviridae和Anelloviridae（单链DNA病毒，ssDNA）也主要经MDA检测，在HP和WTP中增强；而Picornaviridae和Astroviridae（RNA病毒）仅在使用SISPA的样本中检测到；部分病毒属（如Alphainfluenzavirus、Rotavirus等）仅在特定单月出现，呈零星分布。2.4. 人相关病毒指示物：Anelloviridae与Crassvirales。2.4.1. Anelloviridae科表征（Characterisation of Anelloviridae Family）：研究人员在HP、UN、WTP的月度样本中检出Alphatorquevirus、Gammatorquevirus和Gyrovirus属；Alphatorquevirus在HP样本中持续检出且在2025年2月峰值超1500条读取，Gammatorquevirus仅于7月在HP检出，Gyrovirus见于3月和4月的UN及3月的WTP；Alphatorquevirus下属19种，其余两属各2种，HP不同月份物种不共享。2.4.2. Crassvirales在废水样本中的分布（Distribution of Crassvirales Across Wastewater Samples）：研究人员检测到Crassvirales的4个科（Crevaviridae、Intestiviridae、Steigviridae、Suoliviridae）；UN和HP组的整体丰度通常高于WTP（WTP最低且稳定），UN在2025年4月有峰值（Intestiviridae和Suoliviridae主导），UN属水平丰富度低于其他两组，HP呈中间模式且随时间逐渐下降，部分属（如Burzaovirus、Carjivirus）在所有组和时间点恒定存在（流行率100%），Intestiviridae和Suoliviridae普遍最丰富。
讨论部分总结指出，该研究应用MSS表征了三种环境废水的病毒群落，证实了位点特异性病毒丰富度、多样性及组成的差异，反映了人群结构与环境背景的影响；HP和WTP因人群异质性与输入复杂而丰富度高于同质的年轻成人占主的UN；Beta多样性进一步支持HP与UN分离最大；SISPA与MDA分别偏好富集RNA与DNA病毒，提示方法学偏差需谨慎解读但无损其表征价值；Anelloviridae和Polyomaviridae的广泛检出反映人群中持久感染与无症状脱落，可作人群病毒组指标；Crassvirales（感染肠道菌的噬菌体）的稳定性与波动分别对应市政持续输入与校园动态；研究存在月度复合样本时间分辨率有限、读取数非病毒载量直接度量、未评估密度季节等因子、分类分配受数据库与覆盖度限制等不足。结论部分翻译为：综上所述，这些发现支持将鸟枪法宏基因组学整合到常规的废水基流行病学中。区分位点特异性病毒组结构的能力表明，可根据监测目标制定量身定制的监测策略，例如利用HP废水早期检测临床相关或新发病原体，利用市政进水监测人群水平动态。丰富度、组成和时间动力学的差异反映了贡献人群的特征，强化了废水宏基因组学作为综合公共卫生监测的可扩展实时平台的作用。总体而言，本研究证明宏基因组废水监测能够捕获不同环境与人口背景下的独特且有意义的病毒群落结构。重要的是，所使用的方法能够对高度异质性的废水样本进行初步表征，为未来研究提供了宝贵基础。然而，进一步的方学改进，特别是通过开发更准确灵敏的生物信息学流程以提高分类分辨率和促进复杂病毒组数据集的解释，至关重要。因此，随着方法的持续标准化以及与临床数据集的整合，该方法在One Health框架内有望为早期预警系统和社区健康动态监测做出重要贡献。
